研究背景牙周病是口腔两大类主要疾病之一,在世界范围内均有较高的患病率,在我国牙周病的患病率更居于龋病之上。牙周病致病菌(如牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线杆菌等)是牙周病的主要致病因素。牙周病患者,牙槽骨缺损造成周围支持组织不足,最终导致牙齿脱落；对于牙种植患者,必须具有一定高度和宽度的健康牙槽骨才符合手术的适应症；对于缺牙区牙槽骨重度吸收,义齿修复无法达到良好的固位及美观。可见牙槽骨缺损严重影响了患者的生活质量。最初,人们利用自体骨、异体骨、异种骨和非骨移植材料(如生物活性玻璃)的修复或促使牙周组织再生。但是这些方法有一定的弊端：自体骨移植获得的骨量有限；异体或异种骨移植可能引起感染或免疫排斥反应；非骨移植材料由于它们的脆性不能承载负荷。20世纪80年代Nyman、Gottlow等提出了引导组织再生术(GTR),即利用膜性材料作为屏障并提供一定的空间为牙周组织的再生创造条件。根据膜的降解性,可分为可降解性和不可降解性膜,不可降解性膜需要二次手术取出,增加了患者的疼痛和负担。可降解性膜根据聚合物的来源又可分为天然聚合物膜和合成聚合物膜。天然聚合物如胶原、壳聚糖、丝纤蛋白等,合成聚合物如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-聚乙醇酸共聚物、聚己内酯等。大多数天然聚合物膜的成分与人类组织器官的组成成分相同或类似,不会导致炎症或排斥反应,合成聚合物的降解相对较慢,并且可以根据需要合成适当降解时间的膜。近年来随着材料学、分子生物学、组织工程学的发展,又有更多的新技术和新材料应用于临床和实验,如纳米技术、3D打印技术等。纳米材料的性能与相同组成的传统概念上的微米材料有显著的差异,表现出许多有益的性能和全新的功能特性并且能更好的模拟组织器官的微结构聚乳酸-羟基乙酸共聚物是一种制备生物(poly(lactide-co-glycolide), PLGA)膜或支架应用广泛的的合成聚合物,具有良好的生物相容性,可降解性,低毒性,通过调整聚合物中聚乳酸和聚羟基乙酸的比例可以获得降解速率从几周到几年不等的聚合物。姜等制备的纳米纤维支架在体外促进了细胞的PLGA黏附、增殖以及分化,在体内对骨组织的再生起到了正向调节作用。等[8]探讨Hoekstra复合材料对猪骨缺损的修复,结果证明CaP/PLGA复合材料CaP/PLGA对骨再生有效。Li等利用静电纺丝制备的壳聚糖修饰的纳米纤维不仅PLGA提高了纤维的亲水性,改善了机械特性,并加快了PLGA的降解。PLGA壳聚糖是甲壳素脱乙酰基的产物,富含正电荷,结构与细胞(Chitosan, CS)外基质中的多糖类似,具有较好的生物相容性、降解性、低毒性、抑菌性、止血及促进伤口愈合的生物学特性。贾等探讨壳聚糖-抗坏血酸盐治疗牙周炎的作用,结果表明壳聚糖—抗坏血酸盐不但能消除菌斑局部刺激因素,而且可阻断牙槽骨继续破坏。丁等对种植体周围骨缺损修复的研究表明天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料可以修复种植体周围骨缺损并能促进种植体-骨界面形成较为完善的骨结合。等将壳聚糖凝胶用于慢性牙周炎病人的牙Boynuegri周骨缺损区,与单纯牙龈翻瓣手术组相比较,3、6个月后影像学资料分析显示其新骨形成量明显增多。等反壳聚糖纳米颗粒添加到根管封闭剂中,DaSilva4周后,共聚焦激光显微镜结果显示根管封闭剂中添加了壳聚糖纳米颗粒的与不添加纳米颗粒的相比,能更强的抑制生物膜的形成。赵等对壳聚糖葡甘聚糖混合膜对人牙周膜细胞作用的研究显示壳聚糖葡甘聚糖混合膜可以促进的增殖。HPDLCs纳米银拥有显著的抗菌性,抗细菌、真菌和病毒,(nano-Ag, nAg)抗生物膜、抗炎和抗血栓形成促进伤口愈合的作用。纳米银有效的抗菌作用使其在医药、工业等方面得到广泛应用,如手术器械、骨替代生物材料,伤口敷料、导管、化妆品。李等用纳米银预防根管治疗期间痛,临床研究发现纳米银封药组根管治疗期间痛发生率明显低于甲醛甲酚组。庄等关于纳米银对牙本质表面粪肠球菌生物膜的杀菌作用的研究表明0.1%纳米银溶液对粪肠球菌生物膜有较强的渗透能力和杀菌作用。用0.1%纳米银溶液、1.313%次氯酸钠溶液和生理盐水对牙本质表面粪肠球菌粘附进行干预,经0.1%纳米银溶液处理后的牙本质表面粘附的粪肠球菌总菌数活菌数和活菌百分比均低于1.313%次氯酸钠溶液组和生理盐水组。张等的研究表明纳米Ag/TiO2涂层托槽对口腔常见细菌有较强的抗菌效果。纳米技术始创于20世纪80年代,在90年代获得了突破性的进展。纳米技术的发展促使纳米材料的诞生和应用,由于在工程和生物医药方面的潜在作用,纳米技术和纳米材料的应用逐渐得到认可。由于结构上的特点纳米材料具有一些独特的效应,主要包括小尺寸效应和表面或界面效应。因此,其性能与相同组成的传统概念上的微米材料有显著的差异,表现出许多有益的性能和全新的功能特性并且能更好的模拟组织器官的微结构。研究目的本课题旨在制备PLGA、CS纳米粒(nPLGA、nCS)并研究nPLGA、nCS和nAg对牙周膜细胞毒性、增殖与矿化的影响及抗菌特性。为后期用于牙周组织修复与再生的纳米复合支架的制备和生物学性能的研究及临床应用奠定基础。材料与方法第一章nPLGA、nCS的制备及物理学特征1.nPLGA的制备：采用乳化溶剂挥发法制备nPLGA:将100mgPLGA溶于10ml丙酮中,室温下磁力搅拌800rpm/min至完全溶解后缓慢倒入40ml 2%聚乙烯醇溶液中,并继续磁力搅拌8h；待溶剂完全挥发后(溶液呈淡蓝色),15,000rpm/min离心15mmin,去上清,沉淀部分用去离子水清洗三次并重悬后,超声混匀处理20s,自然风干备用。2.nCS的制备：用离子交联法制备nCS：将20mgCS溶于20m1 1%的冰醋酸溶液中,室温下磁力搅拌至完全溶解后,用10M-NaOH调节PH至4.6-6.0,然后再在磁力搅拌下将5m1浓度为lmg/ml的多聚磷酸钠溶液,逐滴滴入壳聚糖溶液中(约15s/滴),待溶液呈淡蓝色时,15,000rpm/min离心15min,去上清,沉淀部分用去离子水清洗三次并重悬后,超声混匀处理20s,自然风干备用。3.特征：分别取nPLGA、nCS悬液适量,用Malvern Zetasizer 3000HS仪分别测定纳米粒的粒径及表面电位；分别将适量nPLGA、nCS悬液滴于铜网上,静置2min后用镊子夹起铜网,并用滤纸吸去多余液体；室温下干燥后,置于透射电镜下观察并进行拍照。第二章nPLGA、nCS和nAg的生物学特性1.人牙周膜细胞的培养：取12-24周岁志愿者(知情同意)因正畸或阻生拔除的无龋、无牙周炎的正畸牙或阻生牙,刮取牙周膜组织,冲洗、剪碎、消化,改良组织块酶消化法培养,待细胞饱和达80%时,按1：2-3的比例传代培养,3-5代人牙周膜细胞用于实验。2.细胞毒性与增殖：实验分为3大组：nPLGA组、nCS组和nAg组；nPLGA组包括空白对照组、1mg/mlPLGA粉末组、0.5mg/ml nPLGA组、1mg/ml nPLG A组和2mg/ml nPLGA组5个亚组；nCS组分为空白对照组、1mg/ml CS粉末组、0.5mg/ml nCS组、1mg/ml nCS组和2mg/ml nCS组5个亚组；nAg组分为2μg/ml、 10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml5个亚组。以1-5×103个/孔浓度接种96孔板,24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性,1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。3.茜素红染色：经nPLGA、nCS处理的牙周膜细胞成骨诱导21day,茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。4.qRT-PCR实验：牙周膜细胞经成骨诱导21day后,qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因(OCN, ALP和OPN)的表达。5.抑菌实验：采用平板菌落计数法检测nPLGA、nCS和nAg对大肠杆菌的抑菌作用。nPLGA对大肠杆菌的抑菌实验分为空白对照组、10mg/ml、15mg/ml和20mg/ml组；nCS的抑菌性分为空白对照组、08mg/mlCS、1mg/mlCS.2 mg/ml CS和5 mg/mlCS组以及0.8mg/ml nCS、1mg/mlnCS、2mg/ml nCS和5 mg/ml nCS组；nAg组分为400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml和1000μg/ml。第三章nPLGA、nCS与nAg混合物的制备及生物学特性初步鉴定实验一nPLGA、nCS混合物的生物学特性初步鉴定1.细胞毒性与增殖：nPLGA与nCS以9：1、8：2、7：3的比例与牙周膜细胞混合培养,于24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性,1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。2.茜素红染色：牙周膜细胞成骨诱导21day,茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。3.qRT-PCR实验：牙周膜细胞经成骨诱导21day后,qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因(OCN、ALP和OPN)的表达。实验二nPLGA、nCS与nAg混合物的生物学特性初步鉴定1.细胞毒性与增殖：根据以上实验选择合适比例的nPLGA和nCS以及适当浓度的nAg,实验分为空白对照组、nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组,于24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性,1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。2.茜素红染色：牙周膜细胞成骨诱导21day,茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。3.qRT-PCR实验：牙周膜细胞经成骨诱导21day后,qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因(OCN, ALP和OPN)的表达。4. nPLGA/nCS/nAg混合物的抑菌性：nPLGA, nCS和nAg抑菌浓度均设为800μg/ml,实验分为nPLGA、nCS、nAg、nPLGA/nCS、nPLGA/nAg、nCS/nAg和nPLGA/nCS/nAg组。统计学分析采用SPSS 20统计软件对数据(x±S)进行one-way ANOVA分析,若方差齐,则用Dunnett和Bonferronili进行两两分析；若方差不齐,则用Dunnett’s分析,以p<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.成功制备nPLGA和nCS本实验分别采用乳化溶剂蒸发法和离子交联法成功制备nPLGA和nCS,Malvern zetasizer测得nPLGA口nCS的粒径、分散系数和电位分别是112.4+ 8.33nm、180.3±11.2nm,0.13±0.05、0.37±0.07,-25.4±2.6mv、+34.0± 0.8mv。透射电镜观察显示：nPLGA呈球形,nCS形态类似球形,纳米粒大小较均匀,形态规则,边缘清晰。2.nPLGA、nCS和nAg的生物学特性nPLGA、nCS和nAg对人牙周膜细胞的相对增殖率均在80%以上,根据IS010993-5,可以认为nPLGA、nCS和nAg对人牙周膜细胞无毒性。nPLGA、 nCS和PLGA、CS粉末一样对人牙周膜细胞的增殖无影响,且各组均与空白对照组无统计学差异p<0.05)。nAg当浓度小于40μg/ml,对人牙周膜细胞的增殖无影响(p<0.05)；但当浓度不小于40μg/ml时,在第5d细胞的OD值低于空白对照组,且与空白对照组有统计学差异(p>0.05)。空白组的茜素红染色颜色明显低于经材料处理的组。不同浓度的纳米材料组与普通材料组颜色没有明显区别,矿化结节也没有明显差异。ALP的相对表达2nPLGA和lnPLGA明显高于其他组,且都与空白组有统计学差异(p<0.05),lnPLGA与PLGA也有统计学差异。PLGA粉末组OCN和OPN的mRNA表达水平明显高于其余组,而且与空白组有统计学差异(p<0.05)。其余组与空白组无统计学差异(p>0.05)；PLGA组OCN的相对表达几乎是2nPLGA组的两倍,并且与2nPLGA组有差异(p<0.05)；PLGA组OPN的表达是lnPLGA组的2倍多,与lnPLGA组有统计学差异(p<0.05);其余组间无明显差异。CS粉末组OCN, OPN的相对表达明显高于其他组,CS组OPN的表达几乎是空白组的10倍,CS组OCN和OPN的表达均与空白组有统计学差异(p<0.05)；OCN的表达CS组几乎是2nCS组的两倍,两者间有统计学差异(p<0.05)：OPN的表达1nCS组几乎是空白组的两倍,与空白组有统计学差异(p<0.05)；CS组OPN的表达明显高于1nCS组和2nCS组,且与两组间有统计学差异(p<0.05)；其余组间无明显统计学差异(p>0.05)。ALP的表达1nCS组和2nCS组几乎是空白组的7-10倍,与空白组有明显的差异(p<0.05)；其余组间无统计学差异(p>0.05)。nPLGA和PLGA粉末对大肠杆菌无抑菌作用。nCS和CS对大肠杆菌的抑菌作用随着浓度的增加逐渐增加。对于nCS组,0.8mg/ml组抑菌率低于2mg/ml和5mg/ml组的抑菌率,并且具有统计学差异(p<0.05),其余各浓度组间无差异(p>0.05)。对于CS粉末组,各浓度组与5mg/ml浓度组均有统计学差异(p<0.05),其余各组间无统计学差异p>0.05)。相同浓度的nCS的抑菌率比CS粉末的抑菌率高,且当浓度不大于2mg/ml时,nCS的抑菌率明显高于CS粉末组,两组间的抑菌率具有统计学差异(p<0.05)。3.nPLGA、nCS和nAg混合物的制备和生物学特性nPLGA和nCS混合物对牙周膜细胞的相对增殖率均在95%以上,根据ISO10993-5 nPLGA和nCS混合物对牙周膜细胞无毒性。经nPLGA和nCS混合物处理的牙周膜细胞的OD值随时间的增加也不断增加,且与空白组无明显差异(p>0.05)。茜素红染色未发现组间有明显差异。9：1组成骨相关基因OCN、ALP的表达明显低于其他组,与空白组有明显的统计学差异(p<0.05)；OPN的表达未发现9：1组与空白组有差异(p>0.05)。8：2组OCN、ALP的表达未发现与空白组有差异(p>0.05)；8：2组OPN的表达明显高于空白组,与空白组有统计学差异(p<0.05)；OCN、OPN的相对表达7：3组是最高的,明显高于空白组,且与空白组有统计学差异(p<0.05)；ALP的表达7：3组未发现与空白组有差异(p>0.05)。其余各组间未发现有明显的统计学差异。nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞的相对增殖率均在95%以上,根据ISO10993-5 nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞无毒性。细胞的OD值随时间的增加不断增加,组间无统计学差异(p>0.05)。nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组茜素红染色颜色较空白组较深,且矿化结节也较空白组明显,两者间颜色和矿化结节无明显差异。nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组OCNs OPN的表达明显高于空白组,且与空白组有统计学差异(p<0.05)；两者间未发现有差异；ALP的表达PLGA/CS/nAg组稍高于空白组,但未发现组间有差异；PLGA/nCS/nAg组PLGA/CS/nAg组间OCN、 ALP、OPN的表达未发现有统计学差异。nPLGA对nCS和nAg的抑菌性无影响,且当nCS和nAg的浓度为0.8mg/ml时,未发现两者对彼此的抑菌性有影响。结论1.成功制备nPLGA、nCS,纳米粒大小较均匀,形态规则,边缘清晰。2.nPLGA、nCS和PLGA、CS粉末一样,拥有较好的生物相容性,对人牙周膜细胞无毒性且不影响人牙周膜细胞的增殖。当nAg浓度不大于50μg/ml时,对人牙周膜细胞无毒性,但浓度大于等于40μg/ml,会对人牙周膜细胞的生长产生抑制作用。nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞无毒性,对牙周膜细胞的增殖无影响。3.nCS和CS对大肠杆菌均有较强的抑菌效果,但浓度低时,nCS的抑菌效果明显比CS强。nAg对大肠杆菌具有较好的抑菌性,浓度为400μg/ml时抑菌率就已超过50%。PLGA和PLGA对大肠杆菌均无抑菌性,而且nPLGA对nCS和nAg的抑菌性无影响。4. PLGA、CS粉末和nPLGA、nCS均在一定程度上促进了膜细胞的矿化能力。nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg在一定程度上促进了牙周膜细胞的矿化能力。