论文部分内容阅读
吐白水软化病是柞蚕一种重要的病害，通常发病于辽宁，吉林，黑龙江等天气寒冷的地区。柞蚕患病的机率约为30%，在严重的地域甚至可以超过70%。研究发现，柞蚕Iflavirus病毒（ApIV）是柞蚕吐白水软化病的病原之一，是小RNA病毒科一株单正链RNA病毒。小RNA病毒科病毒的3C蛋白酶具有高度保守的活性位点。3C蛋白酶在病毒复制中有前体蛋白切割的功能，且在宿主细胞内没有同源位点，常被选为研制抗小RNA病毒抑制剂的靶标。对3C蛋白酶已经进行了长期的大量的研究，但是还没有针对ApIV3C蛋白酶抑制剂的研究。 本研究通过同源建模以及分子动力学的方法构建了ApIV3C蛋白酶的三维结构，通过基于分子对接的虚拟筛选，从含3500多个分子的天然产物数据库中筛选出15个候选化合物，通过体内外的病毒抑制实验，获得异黄酮类化合物Orobol，发现其具有良好的抗ApIV病毒活性。体内实验结果表明，随着Orobol浓度的升高，其抑制病毒复制率越高，当Orobol的浓度达到10μg/ml时，抑制病毒复制率达到80.5%，并且在此浓度下，细胞毒性造成的细胞活性的降低仅为3.42%，细胞毒性低。体内实验通过观察蚕蛹的颅顶板颜色的变化观察蚕蛹感染ApIV的情况，结果表明，阴性对照组蚕蛹的颅顶板呈白色，阳性对照组蚕蛹的颅顶板呈黑色，不同剂量Orobol处理注射ApIV病毒的蚕蛹，随着注射的Orobol的剂量的升高，颅顶板的颜色逐渐变浅，体内实验验证了Orobol有抗ApIV病毒活性。从而发现了一个ApIV3C蛋白酶的先导化合物。研究了阿维链霉菌NRRL8165的摇瓶发酵条件后，利用该菌株通过生物转化获得了Orobol。在动力学模拟与分子对接水平上研究了Orobol与ApIV3C蛋白酶的相互作用模式，结果表明Orobol稳定地结合于ApIV3C蛋白酶的结合口袋处。从而发现了一个新的ApIV3C蛋白酶的抑制剂。对Orobol运用Discovery Studio(DS)中的基于反应的原位生长进行修饰，共得到6个化合物，使用分子动力学模拟（Molecular dynamics simulation，MD）验证，结果表明：修饰的化合物比Orobol有更低的蛋白-配体相互作用能，结合更为紧密。