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第一章ZEB2、E-cadherin在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及意义目的：研究ZEB2、E-cadherin在胃癌组织和胃癌细胞株中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学法检测胃癌组织及非癌性胃黏膜组织中ZEB2、E-cadherin蛋白的表达,分析ZEB2和E-cadherin的表达与临床病理参数的关系,用Kaplan-Meier和Cox回归分析法进行生存分析。采用实时定量PCR法检测人胃黏膜上皮细胞株GES-1及胃癌细胞株SGC7901和HGC27中ZEB2mRNA和E-cadherin mRNA的表达。结果：1.在胃癌组织中ZEB2阳性表达率(59.2%)明显高于非癌性胃组织(19.0%),其表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05),与年龄、性别、肿瘤大小和分化程度无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,ZEB2阳性表达组、阴性表达组患者术后平均生存时间分别为37.603±3.909mo,52.258±4.046mo; ZEB2阳性表达组患者的5年生存率明显低于阴性表达组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。2.在胃癌组织中E-cadherin阳性表达率(56.6%)明显低于非癌性胃组织(100%),其表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期有关(P<0.05)；与年龄、性别和肿瘤大小无关(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示,E-cadherin阳性表达组、阴性表达组患者术后平均生存时间分别为52.473±3.675mo,32.667±4.225mo; E-cadherin阳性表达组患者的5年生存率明显高于阴性表达组患者,差异有统计学意义(P<0.05)。3.ZEB2与E-cadherin在胃癌组织中的表达呈负相关性(r=-0.295,P=0.01)。4.胃癌细胞株中ZEB2mRNA的相对表达量高于人胃黏膜上皮细胞株GES-1(P<0.05),且胃癌细胞株HGC27中ZEB2mRNA相对表达量最高。5.胃癌细胞株中E-cadherin mRNA的相对表达量低于人胃黏膜膜上皮细胞株GES-1(P<0.05),且胃癌细胞株HGC27中E-cadherin mRNA相对表达量最低。结论：1.胃癌组织和胃癌细胞株中均存在ZEB2的高表达和E-cadherin的下调表达,其可能参与了胃癌的发生发展过程。2. ZEB2、E-cadherin在胃癌组织中的表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期及预后相关,其异常表达可能参与胃黏膜的恶性转变,在胃癌浸润转移中起一定的作用。3.在胃癌组织中ZEB2与E-cadherin的表达呈负相关性,ZEB2可能通过抑制E-cadherin的表达促进胃癌的转移。第二章靶向ZEB2基因的shRNA表达载体的构建及鉴定目的：构建靶向ZEB2基因的短发夹RNA (shRNA)真核表达质粒,并进一步研究其对人胃癌HGC27细胞ZEB2表达的抑制效应。方法：设计3条靶向ZEB2基因的shRNA,经退火成互补双链,克隆到质粒pGPU6/GFP/Neo中构建重组载体(pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1,2,3),经酶切鉴定和测序确认后,将3个重组表达载体利用脂质体转染到人胃癌细胞株HGC27,采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,利用Real-time PCR, Western blot法检测转染前后ZEB2mRNA和蛋白表达的情况,并筛选出最佳抑制效率的shRNA表达质粒。结果：1.通过酶切鉴定和测序分析,靶向ZEB2基因的3个pGPU6/GFP/Neo-shRNA重组载体构建成功。2.重组质粒转染HGC27细胞后,经Real-time PCR检测,3个重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1,2,3对ZEB2mRNA表达的抑制率分别为81%,42%,74%；经Western blot检测,3个重组表达载体pGPU6/GFP/Neo-ZEB2-shRNA1,2,3对ZEB2蛋白表达的抑制率分别为73%,33%,64%；与空白对照组(HGC27细胞)相比较,质粒ZEB2-shRNA1抑制ZEB2表达的效应最佳,有显著性差异(P<0.05)。结论：1.成功构建靶向ZEB2基因的shRNA真核表达质粒。2.构建的3个重组表达载体均可有效抑制HGC27细胞中ZEB2的表达,其中ZEB2-shRNA1抑制效果最强,为后续研究打下了基础。第三章ZEB2基因沉默对HGC27细胞生物学行为的影响及其机制的研究目的：研究RNAi介导ZEB2基因沉默对人胃癌HGC27细胞增殖、侵袭及迁移等细胞生物学行为的影响及其机制。方法：实验细胞分为3组,即转染阳性重组质粒ZEB2-shRNA1的实验组,转染阴性质粒ZEB2-shRNA NC的阴性对照组和未转染的的空白对照组。分别检测ZEB2下调前后的人胃癌HGC27细胞生物学行为的变化,采用MTT法检测细胞增殖情况；Transwell小室测定细胞的迁移和侵袭能力；经Western blot法分析ZEB2基因沉默对EMT上皮标志物E-cadherin,间质标志物fibronecin, vimentin及其MMPs家族中MMP2, MMP9蛋白表达的影响。结果：1.MTT结果显示,与空白对照组,阴性对照组比较,实验组中HGC27细胞的增殖能力无明显改变(P>0.05)。2.细胞侵袭实验中,实验组HGC27细胞穿膜细胞数显著少于空白对照组及阴性对照组(14.3±2.5vs.39.5±3.6&38.2±3.2)(P<0.05)。3.细胞迁移实验中,实验组HGC27细胞穿膜细胞数显著少于空白对照组及阴性对照组(21.4±2.5vs.47.3±4.5＆45.7±3.5)(P<0.05)。4. Western blot结果显示,与空白对照组,阴性对照组比较,实验组E-cadherin蛋白的表达上调,而vimentin, fibronectin, MMP2和MMP9蛋白的表达下降。结论：1.ZEB2表达下调可降低HGC27细胞的迁移和侵袭能力,而对HGC27细胞的增殖无明显影响,ZEB2可能在调控胃癌发生侵袭转移过程中起关键性作用。2.ZEB2表达下调可诱导E-cadherin蛋白的重新表达,抑制vimentin, fibronectin, MMP2和MMP9蛋白的表达。ZEB2可能通过介导EMT的发生促进胃癌侵袭和转移,抑制ZEB2的表达能够阻滞EMT的发生。