研究背景: 高血压(hypertension，HT)是一种多基因遗传与环境因素交互作用而产生的以动脉血压升高为特征的全身性疾病，是导致其他心血管疾病的最重要的独立危险因素，已成为日益严重的公共卫生问题。长期的高压血流冲击动脉血管管壁，会引起动脉内膜机械性损伤，进而造成血脂易在动脉壁沉积，形成脂肪斑块并造成动脉硬化狭窄。加之由于全身细小动脉长期反复痉挛，特别是全身细、小动脉硬化，可造成心脏、脑、肾脏等重要脏器的缺血性病变。尽管世界范围内在高血压的预防、监测和治疗等方面有了很大的进步，但目前仍有约70％的高血压患者的血压得不到理想的控制，也不能从根本上逆转疾病的进展和最终防止其并发症的发生，提示在高血压发生发展过程中可能还有其它未知因素的参与。 一、原发性高血压患者血清中α1肾上腺素受体自身抗体的检测及其免疫学特征分析。 目的: 本研究分别以合成的人α1—AR细胞外第一环、第二环、第三环作为抗原肽段，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)技术，检测原发性高血压患者以及血压正常的健康人群血清中抗α1—AR细胞外第一环自身抗体(anti—α1—EC1)、抗α1—AR细胞外第二环自身抗体(anti—α1—ECⅡ)以及抗α1—AR细胞外第三环自身抗体(anti—α1—ECⅢ)的分布情况，以证实哪一种α1—AR的细胞外环有可能成为免疫反应靶位，及其在原发性高血压患者血清中的分布规律和可能的意义。 方法： 1．检测对象： (1)原发性高血压患者73例。 (2)血压正常的健康体检者86例。 2．α—AR细胞外三环抗原多肽的合成。 3．血清自身抗体水平的测定。 4．统计处理。 二．α1肾上腺素受体自身抗体致离体血管的收缩作用以及血管内皮细胞的调节作用。 目的： 1．采用大血管环张力测定技术，观察抗α1肾上腺素受体细胞外第二环抗体(α1—AA)对大鼠容量血管收缩功能的作用，分析该自身抗体对患者血压的影响；采用微血管环技术，观察α1—AA对主要脏器的小血管(包括冠状动脉、大脑中动脉和肾动脉)和外周阻力血管(肠系膜动脉)的直接作用，明确该自身抗体对患者主要脏器和外周阻力血管功能的影响； 2．采用血管平滑肌细胞原代培养技术，观察α1—AA对血管平滑肌细胞静息钙离子水平的影响，以明确该抗体致血管收缩的可能机制； 3．利用大血管环技术，观察α1—AA对SHR和其天然对照WKY大鼠胸主动脉收缩作用的特点，以及内皮细胞和NO在收缩作用的影响，明确高水平的α1—AA在原发性高血压患者血清中存在的意义，并试图探索其可能机制； 4．采用细胞培养技术，观察α1—AA对离体培养的内皮细胞的直接损伤效应及其致内皮细胞损伤的途径，阐明α1—AA在高血压致血管损伤的可能性及其防治的意义。 方法： 1．α1—AA的纯化和鉴定。 2．采用离体胸主动脉环张力测定技术检测α1—AA对大血管收缩功能的影响。 3．采用为血管环张力测定技术观察α1—AA对大鼠肾动脉、大脑中动脉、冠状动脉和肠系膜动脉收缩功能的影响； 4．大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞原代培养，并利用免疫荧光细胞技术对其种类和纯度进行鉴定； 5．利用激光共聚焦显微镜以及Ca2+的荧光指示剂Fluo-3/AM观察α1—AA对平滑肌细胞胞内静息钙水平的影响，分组情况同2； 6．利用人脐静脉内皮细胞的培养技术，观察α1—AA对内皮细胞的直接损伤作用，分组情况同2； 7．收集各处理组的内皮细胞，采用Caspase-3、Caspase-8、Caspasc-9的活性测定法检测内皮细胞的凋亡发生情况； 8．采用LDH酶活性测定法观察内皮细胞的坏死程度； 9．采用吖啶橙/碘化丙啶(AO/PI)染色法和单细胞凝胶电泳观察培养的内皮细胞凋亡率； 10．采用单细胞凝胶电泳观察培养的内皮细胞DNA损伤程度。 三．抗α1肾上腺素受体自身抗体的长期作用下对血管结构和功能的影响。 目的： 1．在体情况下，通过静脉给药的途径观察α1—AA对大鼠在体血压的急性作用； 2．使用人工合成的α1—AR—ECⅡ肽段免疫α1—AA阴性的正常大鼠，建立主动免疫动物模型，观察该抗体的长期作用对在体血压以及离体大鼠血管舒缩功能的影响；以及对内皮细胞损伤情况及其可能的机制；阐明α1—AA参与高血压致血管病理改变的可能性及其防治的意义。 方法： 1．选择雄性Wistar大鼠(200-220g)，通过右侧颈总动脉插管技术和静脉给药方式测定α1—AA对大鼠在体血压急性作用。 2．将α1—AA阴性、体重180-220g的健康Wistar雌性大鼠随机分成两组。 3．采用间接SA—ELISA(Streptavidin—ELISA)方法测定血清自身抗体的水平，检测条件及结果判定方法同第一部分； 4．利用鼠尾动脉血压仪定期观察长期主动免疫对各组大鼠血压的影响； 5．利用离体胸主动脉环张力测定技术检测各组大鼠离体血管舒张和收缩反应的变化； 6．采用定量ELISA试剂盒测定不同时间点大鼠血清中内皮素-1的含量，以反应各组大鼠内皮损伤情况和趋势； 7．利用免疫组织化学技术检测各组大鼠胸主动脉iNOS的表达情况。 内皮素统的分布最为集中，作用也尤为突出。那么，具有类激动剂样作用的α1—AA是否也可以与血管平滑肌上的相应受体(α1—AR)结合，进而产生相应的收缩效应呢?如果是，那么长期高水平的α1—AA是否象α1—AR激动剂那样，也具有致血管病变的病理意义呢?已有的研究报道(包括前期工作)揭示了α1—AA对心脏和血管平滑肌的直接、短期作用，如果能够进一步揭示α1—AA对各类血管(尤其是阻力血管)的直接作用，将会为深入认识α1—AA在高血压发生发展中的作用和机制，同时也为判断不同人群血清中存在α1—AA的病理生理学意义提供科学的实验依据。 α1—AR除分布在血管平滑肌外，还广泛分布在血管内皮细胞，后者在调节血管收缩和舒张功能中具有重要的作用。血液中的α1—AA在血管内流动时，是否可以与血管内皮细胞上的α1—AR结合呢?如果可以，这种结合有可能产生什么样的作用呢?已知，过度的α1—AR激活会导致血管内皮细胞损伤。那么，具有类激动剂样作用的α1—AA是否也有可能导致类似的损伤呢?众所周知，当血管内皮细胞受损后，会导致流经损伤部位的血液中诸多血管活性物质的聚集(如血小板、凝血因子等)进而引发随后的释放反应，从而导致动脉血管管壁一系列的病理改变，如粥样硬化斑块的形成。然而，导致这种血管内皮细胞病理改变的机制尚不完全清楚。因此，如果能够通过直接的实验证据说明α1—AA有可能参与了血管内皮细胞的损伤将有助于认识α1—AA在原发性高血压发病过程中血管病变的机制。 综上所述，设计了本研究课题： (1)采用ELISA方法，筛查原发性高血压患者和血压正常人群血清中针对α1—AR三个细胞外环抗肽抗体的分布情况，并分别分析这三种抗体水平和患者血压的相关性，以初步推测该三种自身抗体可能的临床意义。 (2)通过上述实验，寻找出与患者血压相关的抗体类型，并通过离体实验技术，观察这些自身抗体对正常或高血压大鼠的大血管和微血管功能的直接作用及其可能的机制。 (3)以在体动脉血压为切入点，用急性或慢性动物模型的方法，观察该类抗体对大鼠血压的直接或长期影响；通过血管环张力测定技术，观察在体情况下α1—AA的长期作用对大鼠血管收缩和舒张活动的影响；以血清中内皮素含量为指标，观察在该类抗体长期存在下对在体血管内皮的损伤作用(另题研究该类抗体长期作用对血管平滑肌细胞的功能和形态学影响)，以期阐明α1—AA在高血压的发生发展过程中参与了致血管结构和功能损伤的可能性及其防治的意义。 本课题拟验证的假说：原发性高血压患者血清中存在的α1—AA，有可能通过影响血管结构和功能而与高血压发生发展相关： (1)在原发性高血压患者血清中的α1—AA与患者的血压呈一定的相关性； (2)在离体情况下，α1—AA对大血管具有直接的收缩效应，但对不同重要的组织器官小阻力血管可能表现各不相同；SHR大血管对α1—AA的敏感性可能有所改变，其机制可能与血管内皮细胞受损和NO的生物利用度改变有关；α1—AA本身可能通过与血管内皮细胞上的相应受体结合，从而导致血管内皮细胞的直接损伤； (3)在体情况下，α1—AA对动脉血压的影响可能比较复杂，但α1—AA的长期作用可能会诱导大鼠血管对收缩剂的刺激敏感，舒张功能减弱，同时引起血管内皮细胞损伤。所有这些结构和功能变化可能与原发性高血压患者所表现的血压升高、组织器官血流量下降以及和其它病理学改变密切相关。