背景及意义：　　S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein2，Skp2)属于 F-box蛋白家族成员，与 S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase associated protein1，Skp1)，Cullin-1，RBX1共同组成 Skp2 SCF复合体，发挥 E3泛素连接酶的作用，介导蛋白质的泛素化过程。Skp2也是一种致癌基因，它能调控细胞周期进程、细胞衰老、细胞凋亡、迁移等过程。也有研究表明 Skp2 SCF复合体在表皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)的刺激下，作为蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)的直接 E3泛素连接酶，促进 Akt发生膜聚集和泛素化使其激活并促进癌细胞的糖酵解，而 Skp2的缺失能损伤 Akt的激活和糖酵解过程，这暗示调节Skp2的表达是控制癌细胞糖酵解过程的有效途径。最新研究也发现 Skp2在调节癌细胞干性和自我更新能力上有重要的作用。近年来竞争性内源RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)的越来越被接受，这假说认为 RNA之间可以通过共同微小 RNA(microRNA，miRNA)反应元件(miRNA response elements，MREs)竞争结合 miRNAs，影响游离的miRNAs水平，构成一种内源竞争的关系，实现相互调节。已知 ceRNAs的范围包括 mRNA和非编码 RNA，如假基因（pseudogenes)转录物、长链非编码（Long non-coding RNAs，LncRNAs)、环状R N A（circular RNAs，circRNAs)等。本课题组前期的合作研究结果表明，S k p2与癌细胞 G2/M期转换、多倍体和肿瘤生成密切相关。但目前的研究尚不清楚是否存在与 Skp2构成内源竞争关系的，能够调节 Skp2表达水平的RNA，以及该ceRNA是否会影响 Skp2在肿瘤发生过程中的作用。本项目拟通过 ceRNA视角鉴定 Skp2的ceRNA，及其调节 Skp2表达的模式，将为研发针对 Skp2的分子靶向药物提供新的靶点。　　方法：　　（1）通过生物信息学方法预测 Skp2的ceRNA以及通过实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）检测 Skp2在五株肺癌细胞系和一株肺正常上皮细胞株中的　　初始表达。　　（2）设计合成 ceRNA的siRNA及其对应的阴性对照。用 Lipofectamine2000 siRNA分别转染 LTEP-a2，NCI-H460及 NCI-H1299细胞，运用 qRT-PCR、Western blot分析转染后，Skp2在细胞中的表达变化，用以初步筛选 Skp2的ceRNA。　　（3）用双荧光素酶报告基因实验，Western blot，qRT-PCR进一步筛选出 Skp2的ceRNA以及验证 Skp2与其 ceRNA是否以3′ UTR，miRNA依赖的方式构成竞争性关系。　　（4）通过生物信息学网站、双荧光素酶报告实验、Western blot，qRT-PCR预测、筛选及验证 Skp2与其 ceRNA共同的miRNAs。　　（5）通过 MTT和克隆实验分析 Skp2与其 ceRNA对细胞生长和增殖的影响。　　（6）通过流式细胞术分析Skp2与其 ceRNA对细胞周期和细胞凋亡的影响。　　（7）通过 Western blot检测 Akt的磷酸化水平，检测 ceRNA对磷酸化 Akt的影响。　　（8）通过 qRT-PCR检测肺癌组织中 Skp2与其 ceRNA的表达，分析 Skp2与其ceRNA在临床样本中的相关性。　　结果：　　（1）在 StarBase2.0中预测到 Skp2的ceRNA有 ZFP36L2，BCL11A，PCNX，PGM2，TMEM24。Skp2在肺癌细胞 LTEP-a2中相对高表达；在 NCI-H1299，NCI-H460中相对低表达。　　（2）干扰上述初步筛选的ceRNA后，检测 Skp2在蛋白水平和 mRNA水平的表达变化，进一步筛选出 Skp2的ceRNA为 ZFP36L2，PCNX，TMEM245。　　（3） PCNX与 Skp2以3′UTR，miRNA依赖的方式构成竞争性关系。　　（4） PCNX与 Skp2的转录物通过竞争结合 miRNA-26，miRNA-182，miRNA-340，miRNA-506，实现相互调节。　　（5）干扰 PCNX与 Skp2的表达抑制肺癌细胞的生长和增殖，而过表达 PCNX与 Skp2的3′ UTR促进肺癌细胞的生长和增殖，即 PCNX与 Skp2对肺癌细胞的生长和增殖有促进作用。　　（6）干扰 PCNX与 Skp2的表达阻碍肺癌细胞的周期进程、促进细胞的凋亡；而过表达 PCNX与 Skp2的3′ UTR能促进细胞的周期进程抑制细胞的凋亡，即 PCNX与 Skp2促进肺癌细胞的周期进程，抑制细胞的凋亡。　　（7）干扰 PCNX能抑制由 EGF诱导的Skp2 SCF复合体调节的Akt磷酸化，且 PCNX的抑制作用因共转染 siDicer而降低。即 PCNX的转录物作为Skp2的ceRNA，可调节 Akt的磷酸化，影响 Akt的活化状态。　　（8）在肺癌临床样本中，Skp2和 PCNX在癌组织中的表达均高于癌旁组织。同时，在 Skp2低表达的病例中，PCNX也低表达；Skp2高表达的病例中，PCNX也高表达。反之亦然，这暗示 Skp2和 PCNX在肺癌中可相互调节。　　结论：　　本研究首次在 RNA水平上筛选出 Skp2的ceRNA为 PCNX，同时阐明了PCNX与 Skp2转录物通过竞争结合 miR-26，miR-182，miR-340，miR-506构成竞争性内源 RNA，且两者的竞争关系以3′ UTR和 miRNA依赖的方式相互作用。同时 PCNX的转录物作为 Skp2的ceRNA，不仅调节 Skp2的表达，也具有与Skp2类似的生物学功能，即能促进细胞的生长、增殖、细胞周期进程以及抑制细胞凋亡。此外，PCNX还可影响 Skp2 SCF复合体调节的Akt的磷酸化状态，可能参与 Akt的信号通路。这些结果均说明，PCNX的转录物是 Skp2的ceRNA，通过作用 PCNX可以调节 Skp2的表达及其生物学功能，这为研发针对 Skp2的分子靶向药物提供了理论依据。