荞麦（Fagopyrum esculentum）作为一种功能性食物,越来越受到人们的广泛关注。它不仅具有丰富的营养价值,而且还有很高的药用价值。荞麦蛋白由较为独特的氨基酸组成。许多实验表明荞麦中的黄酮类物质含量较高,其产品具有明显的降低胆固醇和降血压等生物学作用,而且对糖尿病也有一定的疗效。然而,近年来的研究发现,荞麦中含有的过敏性成分通常可使接触或食用它的人产生过敏症状。日本和韩国学者先后从甜荞麦中分离获得16kDa、22-24 kDa、34-38 kDa及69 kDa等分子量不等的过敏蛋白。虽然对荞麦主要过敏原的确定还没有得到统一,各个研究小组的报道也存在一些差异,但一般认为22-24 kDa蛋白是荞麦中的主要过敏原。目前,国内外关于苦荞麦过敏的研究较少。本实验室曾以我国云南苦荞种子为原料,经分离纯化获得纯度均一的24 kDa天然蛋白,命名为TBa（tartary buckwheat allergen）,通过免疫学检测发现其为苦荞中的主要过敏原。之后采用基因克隆法首次获得该苦荞过敏原的结构基因序列,并于2002年在GenBank登录（登录号为AY044918）。 本实验是在已获得TBa结构基因的基础上,进行TBa的原核表达。首先将该基因克隆到原核表达载体pET-28a上,后将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。结果表达产物大部分以包涵体的形式存在,进一步经Ni²⁺-NTA琼脂糖柱亲和纯化,得到纯度达95%以上的目的蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白复性,复性产率达到约68%。Westernblot证实目的蛋白N端带有6个组氨酸标签。ELISA检测表明目的蛋白与IgE有特异性的结合,具有较高的免疫学活性。 根据TBa的结构基因序列推导出该蛋白的氨基酸编码序列,应用Antigenic程序对推导出来的氨基酸序列进行抗原表位预测。初步的预测结果表明在成熟的TBa分子中包含八个抗原表位区段。选择含有抗原决定簇可能性最大的两个区段,根据其碱基序列,设计引物,克隆获得两个表位的基因片段。分别将两个基因片段连接到原核表达载体pET-32a上,并将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。对分离纯化后的表达产物进行免疫活性鉴定,初步表明两个推测的抗原表位区段均具有一定的抗体结合活性。