龋病严重危害着人类口腔和全身健康。目前公认的“生态菌斑学说”认为龋病是菌群失衡性疾病,由于牙菌斑生物膜菌群发生生态变化,导致牙齿矿物质和生物膜之间的生理平衡失衡,最终使龋齿平衡向脱矿和病变方向倾斜。口腔微生物种类的多样性和复杂性较高,近年大量研究发现致龋特性除了依赖于已知致龋菌如变异链球菌等外,同时还有大量其它口腔细菌被认为与龋病的发生密切相关。截止目前,人们对致龋微生物的认识并不完整,对发病机制解释并不充分。宏基因组学是一种独立于分离培养的微生物研究方法,能够较为全面地反映口腔中微生物种类和数目的真实情况,被广泛应用于肠道、皮肤、口腔等疾病的微生物组研究。其中16S r RNA扩增子测序技术已成为研究环境样品中微生物群落组成及结构的重要手段。氟化物是一种公认的防龋剂,其已经成为防龋应用的优先选择。局部用氟的防龋效果及作用机制已得到大量研究证实,但人们对氟化物的确切抗龋机制尤其是对菌斑微生态的影响仍未完全清楚。关于龋病相关的口腔微生物及氟化物对口腔微生物影响的研究往往基于分离培养技术并集中在少数致龋菌上,而在“生态菌斑学说”指导和宏基因组学技术应用下的国内外相关研究并不多。基于以上研究背景,本课题拟采用宏基因组学技术（16S r RNA测序技术）,通过对不同患龋程度儿童的龈上菌斑及氟化物应用后菌斑微生物多样性的变化进行分析,以探讨儿童龋病的微生物学病因及氟化物对菌斑微生态的影响,从而为儿童龋病的防治及氟化物的优化应用提供新的数据。实验一高龋与无龋儿童龈上菌斑微生物差异的宏基因组分析【目的】观测不同龋患程度儿童乳牙龈上菌斑微生物的组成和差异,进一步认识龋病的微生物病因。【方法】选择3岁龄儿童为研究对象,根据WHO龋检测标准,分为高龋组（dmft≥5）和无龋组（dmft=0）各12名,采集龈上菌斑,基于Ion S5TMXL平台（Thermofisher）进行16S V4区域测序并对比分析。【结果】1.测序数据质量评估本实验共得到1514208条有效序列（Clean Reads）,平均每个菌斑样本处理后的Clean Reads为63092条,Clean Reads的平均长度为414.63 bp,GC碱基的含量为53.89%,Reads保留比为93.17%,提示测序数据合理可靠,可用于后续分析。2.OTU分析根据97%相似性将序列聚类为OTUs,高龋组获得438个OTUs,无龋组获得447个OTUs,其中353个OTUs为两组共有。3.物种注释统计通过与SILVA132数据库比对,可注释到14个菌门、21个菌纲、53个菌目、93个菌科、150个菌属、159个菌种。两组中,相对丰度较高的优势菌门及其分别在高龋组和无龋组的相对丰度为:放线菌门（40.5%,33.2%）、变形菌门（22.9%,14.1%）、厚壁菌门（12.6%,15.3%）、拟杆菌门（11.7%,15.8%）、梭杆菌门（7.6%,15.2%）等。相对丰度较高的优势菌属及其分别在高龋组和无龋组的相对丰度为:放线菌属（15.7%,11.4%）、棒状杆菌属（12.4%,14.0%）、奈瑟菌属（9.4%,4.5%）、罗氏菌属（7.2%,3.6%）、链球菌属（5.8%,5.0%）、二氧化碳嗜纤维菌属（5.1%,7.0%）、纤毛菌属（4.3%,11.2%）、劳特罗普氏菌属（3.5%,3.1%）、梭杆菌属（3.3%,3.9%）等。推测以上微生物可能是在门水平及属水平上的龈上菌斑核心微生物群。此外,两组微生物样本中均存在低丰度的未曾定义的新物种。4.物种多样性分析Alpha多样性分析显示所有样本的Good’s coverage评估达99.9%以上,且测序深度均达到饱和,提示该测序数据量全面、可靠;高龋组物种多样性低于无龋组,但无显著统计学差异（P＞0.05）,提示在龋病的发展过程中菌斑中的微生物物种多样性有下降趋势。5.微生物群落结构分析Beta多样性分析显示高龋和无龋样本群落结构相似,组间未见显著分离,提示高龋和无龋儿童龈上菌斑有着相似的微生物群落构成。6.组间差异物种分析LEfSe分析显示,在几乎各个分类学水平上都有相对丰度存在显著差异的物种,即高龋组显著丰富的微生物菌群有Delta-变形菌纲、微球菌目、微球菌科、罗氏菌属、嗜血杆菌属、金氏菌属、副流感嗜血杆菌、龋齿罗氏菌（种）、中间链球菌（种）、奈瑟杆菌（种）等（P＜0.05）;无龋组显著丰富的微生物菌群有梭杆菌门、梭杆菌纲、梭杆菌目、纤毛菌科、纤毛菌属、LeptotrichiasporalcloneIK040（种）、颗粒二氧化碳嗜纤维菌（种）、颊纤毛菌（种）、TM7phylumsporalcloneFR058（种）等（P＜0.05）。变异链球菌的相对丰度在两组之间未发现显著差异（P＞0.05）。远缘链球菌仅在高龋组中被检出。说明高龋和无龋儿童龈上菌斑微生物种类存在明显差异,不同微生物对龋病的发生和发展有不同的作用。7.功能基因预测分析PICRUSt分析显示,较为丰富的代谢通路及其在高龋组和无龋组中的占比为:膜转运（12.24%,12.47%）、碳水化合物代谢（9.92%,10.04%）、氨基酸代谢（9.79%,9.67%）、复制和修复（9.10%,8.95%）、翻译（6.31%,6.23%）、能量代谢（5.83%,5.79%）功能。整体表现为高龋组的微生物物质代谢与能量代谢的多个相关子功能较无龋更为丰富（P＜0.05）。【结论】3岁儿童乳牙龈上菌斑微生物群落呈现多样性,不同龋患程度儿童口腔微生物群落在不同分类和功能水平上呈现显著差异,且两组微生物样本中均存在低丰度未定义的新物种。变异链球菌的相对丰度并不高,远缘链球菌作为龋病特异性物种值得更多关注。实验二氟化物对乳牙龈上菌斑微生态影响的宏基因组分析【目的】观测含氟涂料应用后不同龋患程度儿童乳牙菌斑生物膜内微生物多样性的动态变化及差异,丰富氟化物对牙菌斑作用的认识,为优化氟化物防龋应用提供更多的数据资料。【方法】研究对象及分组同实验一,含氟涂料采用Duraphat?,分别采集涂氟前、涂氟后第3天、涂氟后第2周末的龈上菌斑,基于Ion S5TMXL平台（Thermofisher）进行16S V4区域测序并对比分析。【结果】1.测序数据质量评估所有样本共得到4884768条有效序列（Clean Reads）,平均每个菌斑样本处理后的Clean Reads为67844条,Clean Reads的平均长度为412.85 bp,GC碱基的含量为54.18%,Reads保留比为94.04%,提示测序数据合理可靠,可用于后续分析。2.OTU分析无龋组三个时间点分别测得447、707、492个OTUs,其中有384个OTUs为三个时间点共有。高龋组三个时间点分别测得438、544、470个OTUs,其中有370个OTUs为所有组共有。3.物种注释统计通过与SILVA132数据库比对,涂氟后第3天样本可注释到20个菌门、30个菌纲、60个菌目、112个菌科、205个菌属、192个菌种,明显较基线丰富;涂氟后第2周末样本可注释到16个菌门、23个菌纲、51个菌目、94个菌科、154个菌属、162个菌种,接近基线水平。氟化物干预后,高龋和无龋组相对丰度较高的优势菌门均为放线菌门、变形菌门、拟杆菌门、梭杆菌门、厚壁菌门等;相对丰度较高的优势菌属均为放线菌属、罗氏菌属、奈瑟菌属、棒状杆菌属、纤毛菌属、劳特罗普氏菌属、链球菌属、丛毛单胞菌属、嗜血杆菌属、梭杆菌属、聚集杆菌属、卟啉单胞菌属等。提示以上微生物可能是在门、属水平上的龈上菌斑核心微生物群。4.物种多样性分析Alpha多样性分析显示所有样本的Good’s coverage评估达99.89%以上,且测序深度均达到饱和,提示该测序结果已经足够反映当前研究对象所包含的微生物多样性。无龋组和高龋组涂氟后,Alpha多样性指数均呈现先升高后下降的趋势,在第2周末基本恢复至接近基线水平,各时间点之间Alpha多样性指数未见显著差异（P＞0.05）。提示牙面涂氟的氟化物并不能明显改变菌斑微生态中物种的丰富度。5.微生物群落结构分析Beta多样性分析显示,氟化物应用后物种群落结构在一定程度上发生变化,且无龋和高龋组的变化程度有差异。无龋组涂氟后第3天,Beta多样性指数显著下降,至第2周末时显著上升至接近基线水平（3d vs 0d,P＜0.05;2w vs 3d,P＜0.05;2w vs 0d,P＞0.05）,提示氟化物能够通过影响无龋组样本的物种群落结构扰动牙菌斑微生态,且这种影响具有时效性。高龋组涂氟后,Beta多样性指数呈现先升高后下降趋势,但无统计学差异（P＞0.05）,提示氟化物对高龋儿童牙菌斑微生态的扰动作用不明显。6.时间组间差异物种分析LEfSe分析显示,氟化物对一些物种的相对丰度有显著影响,且相同物种在高龋组和无龋组中受氟化物影响的程度各有不同。无龋组涂氟后第3天,拟杆菌门、二氧化碳嗜纤维菌属、弯曲杆菌属、有害月形单胞菌、颗粒二氧化碳嗜纤维菌等物种的相对丰度显著下降,至第2周末时逐渐恢复至接近基线水平（3d vs 0d,P＜0.05;2w vs 3d,P＞0.05;2w vs 0d,P＞0.05）。提示氟化物对无龋组一些物种有明显的抑制作用。高龋组涂氟后,金氏菌属相对丰度持续下降（3d vs 0d,P＜0.05;2w vs 3d,P＞0.05;2w vs 0d,P＜0.05）,而核心微生物菌属相对丰度并未出现显著变化（P＞0.05）。提示牙菌斑核心微生物菌属并不受氟化物的明显影响。7.功能基因预测分析PICRUSt分析显示,氟化物能够显著影响龈上菌斑微生物代谢功能。无龋组涂氟后第3天,“细胞运动”子功能的预测基因拷贝数显著低于基线,在第2周末时恢复至基线水平（3d vs 0d,P＜0.05;2w vs 3d,P＞0.05;2w vs 0d,P＞0.05）;“能量代谢”子功能的预测基因拷贝数有下降趋势,至第2周末时有所上升（3d vs 0d,P＞0.05;2w vs 3d,P＜0.05;2w vs 0d,P＞0.05）。提示氟化物可能抑制细菌的细胞运动和能量代谢功能。高龋组涂氟后2周,在“重组和修复”子功能的预测基因拷贝数显著下降（3d vs0d,P＞0.05;2w vs 3d,P＞0.05;2w vs 0d,P＜0.05）,提示氟化物可能影响细菌DNA损伤后的修复过程。【结论】氟化物的应用使得菌斑微生物的多样性和物种群落结构发生了一定的变化,一部分物种出现丰度变化。氟化物能够在一定程度上扰动牙菌斑微生态,且对无龋组的扰动作用较高龋组更明显。氟化物可能影响细菌的代谢功能。牙菌斑生物膜中可能存在几乎不受氟化物影响的“口腔核心微生物组”。金氏菌属值得更多关注。本研究丰富了氟化物对口腔微生物影响的认识。【小结】综上所述,本研究通过宏基因组学技术（16S rRNA测序分析）,研究了3岁龄不同龋患程度儿童乳牙龈上菌斑微生物的组成和差异,以及氟化物对乳牙菌斑微生态的影响,结果发现:高龋和无龋儿童龈上菌斑物种多样性和群落结构相似,但在不同物种分类和代谢功能水平上呈现显著差异。氟化物应用使得龈上菌斑微生物多样性发生一定程度变化,一部分群落微生物出现丰度变化,菌斑微生物的代谢过程也受到了影响,说明氟化物能够在一定程度上扰动牙菌斑微生态,但不会导致菌斑内严重的菌群失调。牙菌斑生物膜中可能存在“口腔核心微生物组”,以及低丰度的未定义的新物种。因此,在氟化物防龋作用机制中,推测氟化物对致龋菌的抑制作用是有限的,而更多是氟离子通过对牙面脱矿/再矿化平衡的物理化学作用实现的。本研究结果不仅证实了先前关于口腔微生物区系与学龄前儿童龋病关系的研究结果,而且还探索了龋病和健康儿童龈上菌斑相关的微生物菌群。本文为乳牙龋病的微生物因素研究提供了新数据,丰富了氟化物对菌斑微生态影响的认识,对优化氟化物应用于儿童龋病防治有重要意义。