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水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus),会引起水稻黑条矮缩和玉米粗缩病,导致在中国、日本、韩国和其他亚洲国家农作物产量严重损失。感染了水稻黑条矮缩病毒后水稻的主要表现为叶色浓绿,背部叶脉和茎秆上初现蜡白色,后变成褐色的短条瘤状隆起。水稻黑条矮缩病是由灰飞虱为传播介体昆虫的一种病毒病。RBSDV粒子是由直径大约在75-80纳米之间的双层粒子以及S1到S10的10条双链RNA组成的二十面体结构。尽管人们致力于揭示病毒与宿主之间的相互作用关系,但到目前为止,水稻黑条矮缩病的发病机理仍不清楚。为了明确感染RBSDV后水稻转录组的改变情况,我们对一个易感水稻品种抗条武育粳3号(KTWYJ3)进行了全转录组测定。感染了 RBSDV的水稻样本与未感染的健康样本在典型病害症状出现后的两个时间点取样(两个时间点的样品分别用组Ⅰ和组Ⅱ表示),并进行转录组比较。第Ⅰ组中感染RBSDV的样本与健康样本中有281个显著差异表达基因(DEGs),其中102个基因上调,179个基因下调。第Ⅱ组中有2592个DEGs,其中1588个基因上调,1004个基因下调。两组中共有的DEGs有66个,这66个DEGs中有36个DEGs的表达模式是相似的。进一步分析表明,在感染RBSDV后一些与疾病防御和抗逆性相关的基因(如编码黄酮醇合成酶和水稻细胞壁相关激酶基因OsWAK32)表达上调,而与叶绿体相关的基因(如叶绿素合成酶基因Os05g28200.1)表达下调。此外,一些与株高相关的基因(例如丙酮酸激酶基因Os11g05110.1)差异表达。该结果表明这些基因可能参与RBSDV引起的矮化症状。总之,我们对水稻感染水稻黑条矮缩病毒后全转录组分析有助于全面了解水稻与RBSDV相互作用以及水稻黑条矮缩病发病的生物学基础。为了获得无选择标记基因的抗黑条矮缩病转基因水稻,我们以编码水稻黑条矮缩病毒非结构蛋白P7-2和P8基因S7-2和S8作为RNA干扰(RNAi)的靶标。P7-2是一个F-box蛋白,通过泛素化途径参与植物和病毒的相互作用,P8是具有转录抑制活性的病毒粒子核心蛋白。我们采用含有S7-2或S8基因RNAi结构的双T-DNA载体转化水稻愈伤组织,获得了含有目的基因以及潮霉素抗性选择标记基因(HPT)的转基因水稻。从这些转基因水稻后代,获得了无HPT基因的植株。T5代含有S7-2-RNAi或S8-RNAi的纯合转基因系在田间自然条件下经带毒灰飞虱的侵染下表现出高抗水稻黑条矮缩病毒。这些结果表明,通过RNA干扰技术抑制S7-2或S8基因的表达是一种有效地提高水稻对黑条矮缩病毒抗性的手段。已有实验结果表明,病毒侵染植物后通过抑制或激活宿主基因转录可能会导致明显的病症。对水稻黑条矮缩病毒感染早期引起的基因表达变化的了解有助于理解水稻黑条矮缩病发病机制,并寻找抵抗黑条矮缩病的抗性基因。我们对接种水稻黑条矮缩病毒后三个时间点(3、8和22天)的水稻利用qRT-PCR分析矮缩症状相关基因、防卫和胁迫相关基因、叶绿体和光合作用相关基因表达随时间的变化情况。研究结果表明,一些抗病相关基因和细胞壁发育相关的基因,如纤维素合成(CESA)基因表达发生改变,其中CES41和CES47基因的表达下调,这可能是造成植株矮化的原因之一。因此,引起矮缩症状的原因除株高相关基因表达发生变化外,可能细胞壁结构和生物合成相关基因表达的变化也具一定的作用。与对照比较,我们发现丙酮酸激酶基因在接种后3天表达显下调。OsWRKY基因的表达也发生显著变化,例如,OsWRKY78基因的表达在接种后3天显著升高,但在第8天显著降低,到第22天又显著上调。另一方面,一些叶绿体和光合作用相关基因在病毒感染早期表达显著降低,其中叶绿体相关基因的结果与RNA-Seq结果一致。小RNA(microRNA,miRNA)在发育、非生物胁迫和对病原体的反应中发挥重要作用。植物小RNA参与病毒感染,这些病毒应答的小RNA与其靶基因和病毒致病性有关。已有研究结果在水稻不同组织中鉴定一些参与RBSDV感染的小RNA,这些小RNA和其靶基因在水稻受到RBSDV感染后表达量发生变化。我们过表达RBSDV非结构蛋白P7-1和P9-1,即P7-1OvE和P9-1OvE,其目的在于探讨P7-1和P9-1对水稻RBSDV应答的小RNA和其靶基因表达的影响。结果显示在T3代转基因水稻中因过表达P7-1和P9-1,一些病毒应答小RNA靶基因表达发生改变。如在过表达P7-1株系中,miR159和miR169靶基因Os01g59660和Os03g48970显著上调;在过表达P9-1株系中,miR166靶基因Os03g018900和Os10g33960显著上调;其中,最显著变化的是在过表达P7-1株系中miR171靶基因Os02g44370表达量的变化,上调超过3倍,其编码scarecrow-like转录因子。水稻黑条矮缩病毒应答小RNA靶基因表达量的变化表明这些小RNA表达的变化可能会干扰其对不同发育过程的调节作用。总之,我们的研究从另一个方面表明非结构蛋白P7-1和P9-1在水稻黑条矮缩病的发展过程中的重要作用,其参与了病毒与宿主的互作过程。