中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),俗称河蟹。因其营养价值高,味道鲜美,受到广大消费者的喜爱,是我国的名特优水产品。近年来中华绒螯蟹养殖朝着集约化、规模化不断发展,提高中华绒螯蟹的生长性能、降低早熟率等一直以来就是人关注的焦点。色氨酸作为一种必需氨基酸,其代谢会产生如5-HT等多种活性物质,它们与动物体生长、发育、摄食、行为等诸多方面密切相关。研究表明饲料中添加色氨酸可提高一些动物的生长性能,提高成活率,促进采食和降低攻击行为等。而之前的免疫组化分析表明5-HT受体在中华绒螯蟹肠道等组织中广泛分布,暗示了色氨酸和5-HT在中华绒螯蟹体内有诸多生理作用;浸泡和注射实验表明5-HT可一定程度上促进中华绒螯蟹的蜕壳,缩短食物在肠道内的运行时间。本文使用不同色氨酸含量的饲料对中华绒螯蟹进行了30d的投喂,发现色氨酸饲料一方面提高中华绒螯蟹的成活率并降低断肢率,另一方面可提高摄食量,肝胰腺中蛋白酶、脂肪酶活性也升高了,后续使用高清摄像头摄像实验表明色氨酸饲料提高了中华绒螯蟹的摄食率和摄食过程中的运动时间。这说明色氨酸确实对中华绒螯蟹的摄食有促进作用,这与其他动物的一些研究相似。本实验还发现色氨酸可以促进中华绒螯蟹的蜕壳,为了深入研究,第三章选取调控蜕壳的主要器官—Y-器官在正常和性早熟两种情况下进行了转录组分析。色氨酸的代谢产生的5-HT是一种重要的神经递质。其发挥作用是通过介导相应的受体实现的,中华绒螯蟹5-HT基因克隆方面进展缓慢,无法从分析功能等角度更深入的研究色氨酸和5-HT对中华绒螯蟹的生理作用,所以第四章利用第三章转录组数据对5-HT1B受体基因进行了克隆,现得到了3’端和5’端部分片段,并通过荧光定量的方法对5-HT1B受体在各组织和不同色氨酸饲料投喂后四种组织的表达情况进行了分析,为后续更深入的研究提供了资料。具体结果如下:1)本研究首先用不同色氨酸含量的饲料对中华绒螯蟹进行投喂,实验周期为30d。旨在探讨饲料中添加色氨酸对幼蟹生长性能的影响。试验选取初始体重为2.45g左右的幼蟹360尾,随机分成4组,每组3个重复,在室内循环系统分别投喂各自的色氨酸饲料。各组分别投喂色氨酸含量为0.36%(A,对照组)、0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)色氨酸的4种饲料。记录实验前后体重、体长、体宽、体高,以及断肢和蜕壳情况,每隔7d测量各组摄食量。30d时解剖采集各组中华绒螯蟹肝胰腺用于蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的测定。结果表明:各组中华绒螯蟹体重、体长、体宽和体高增加率以及肝体比均无显著差异(P>0.05)。D组的存活率与对照组相比差异显著(P<0.05)。C组的断肢率最低,与A组相比差异显著(P<0.05)。C组的蜕壳率和蜕壳前期的比例显著高于A组和B组。第7d时,B组和D组的摄食量显著高于A组;第21d时,D组摄食量显著高于B组。饲料中添加色氨酸可提高中华绒螯蟹存活率、蜕壳率和摄食量,并降低断肢率。2)随后测量各组消化酶活性,结果表明:各试验组肝胰腺淀粉酶活性无显著性差异。脂肪酶活性C组最高,显著高于A组(P<0.05),但B组和D组与A组相比无显著性差异(P>0.05)。而B组的蛋白酶活性均显著高于A组、C组和D组(P<0.05)。由此可见,饲料中添加色氨酸可提高脂肪酶活性和蛋白酶活性。3)色氨酸是5-HT和褪黑激素等生理活性物质的前体,可以促进动物采食,降低日粮优质蛋白用量,削弱打斗行为,提高成活率。本部分旨在研究色氨酸水平对中华绒螯蟹摄食过程中运动时间和摄食率的影响,以期探索幼蟹饲料中适宜的色氨酸水平,并为色氨酸在此过程中生理调节作用的深入研究奠定基础。试验采用单因素4水平实验设计。将60只体重为14.27±1.29g的1龄幼蟹随机分成4组,每组15只。对照组饲喂基础饲料,色氨酸水平为0.36%(A,control)。其余三组添加不同剂量的L-色氨酸,饲料中实测含量分别为:0.47%(B)、0.73%(C)、和1.05%(D)。将幼蟹单只暂养于规格为35×25×10cm聚乙烯水箱中7d后,试验期间8点分别投喂1g左右的饲料。使用高清摄像头记录中华绒螯蟹在喂食1h内的运动时间以此计算中华绒螯蟹在摄食过程中的运动时间比例;并在1h后用200目的纱网收集残饵以计算摄食率;用SPSS软件进行数据分析。结果表明:B组和C组饲料组明显增加了中华绒螯蟹在摄食过程中的运动时间。此两实验组蟹在摄食过程中的运动时间比例分别为30.36±13.27%和32.26±14.50%,与对照组17.13±8.48%的运动时间相比差异显著(P<0.05),D组为24.04±11.98%与对照组间差异不显著。本研究发现,L-色氨酸能提高中华绒螯蟹的摄食率,其中C组和D组组摄食率分别为5.7±1.16%和5.52±1.03%,明显高于对照组(4.46±0.68%),且两组间存在差异显著(P<0.05)。结论:L-色氨酸参与了中华绒螯蟹摄食运动和摄食过程,且有促进作用。综合考虑,饲料中色氨酸的含量为0.75%时比较合适。4)本研究采用Illumina Hiseq 2000高通量测序技术对正常与性早熟雌蟹Y-器官转录组数据进行了比较分析,以期挖掘Y器官中差异基因的代谢通路和5-HT受体基因信息,并为探究性早熟基因水平的原因提供资料。测序分别获得44 619538和43 052 958个clean reads,比对发现2655个差异表达基因,Gene Ontology(GO)功能分类分析将文库中的差异表达基因归类到3大功能(生物过程、细胞组分和分子功能)的42个类别中。KEGG富集分析,将文库中的差异表达基因富集到134条特定的KEGG代谢途径,其中4条是显著性富集,包括酮体合成和降解、丁酸甲酯代谢、神经营养因子信号通路和碱基切除修复通路。通过RNA-seq技术获得了丰富的中华绒螯蟹Y-器官转录组信息,为中华绒螯蟹新基因克隆、性早熟成因与预防和Y-器官的研究提供有价值的数据。基于转录组分析,获得了大量5-HT受体序列信息,比对数据库发现这些序列为1A、1B、1D、2A、2B、2C、7等类型,可作为后续RACE实验的核心片段。5)基于转录组分析数据,进行了后序基因克隆的研究。获得了5-HT1B受体的主要序列,此后分析了此基因在不同组织中的表达情况以及在色氨酸饲料投喂后其在不同组织中的表达情况进行分析。根据正常与性早熟中华绒螯蟹的Y-器官转录组数据,设计了5HT1B受体的引物:5HT1F和5HT1R扩增得到从而得到核心片段。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术,得到了中华绒鳌蟹5HT1B受体基因部分片段。测序结果表明扩增到的中华绒螯蟹5HT1B受体片段长为1732bp,其中开放阅读框长1080bp,编码359个氨基酸。经BLASTp分析显示,中华绒螯蟹5HT1B受体片段与北黄道蟹(Cancer borealis)和美洲海螯虾(Homarus americanus)的5-HT1B受体同源性高达96%和86%。并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了5HT1B受体基因在中华绒螯蟹的不同组织表达情况,结果显示上述两者基因在肝、肌肉、卵巢、血、肠道、鳃、胸神经、Y-器官、脑神经和眼柄10个组织中均有表达,并且均在肝胰腺中高水平表达,同其他组织表达量差异显著(P<0.05)。5-HT1B受体mRNA在不同色氨酸含量饲料组的四种组织中均有表达,且呈现下降趋势。这表明5-HT1B可能参与了色氨酸饲料提高中华绒螯蟹生长性能的过程。