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研究背景:重度抑郁症（major depression disorder,MDD）是一种严重的精神疾病,以情绪低落、认知障碍和社会功能受损为特征。抑郁症可由多种因素诱发,具有重叠的因果途径,其发病机制目前尚不明确。由于缺乏可靠的生物标志物,抑郁症诊断困难,误诊率较高。而且,目前抗抑郁药物也存在着起效慢、副作用明显、效果不佳等问题。因此,深入研究抑郁症的发病机制,寻找可靠的生物标志物和治疗靶点对临床工作具有重要意义。因具有闭合环状结构,环状RNA（circular RNA,circRNA）在细胞中比其线性转录物更稳定,半衰期更长。CircRNA最常见且目前广泛应用的功能是作为miRNA海绵,已有多篇研究报道circRNA通过靶向结合miRNA参与疾病的发生、发展。转录组分析发现,多种circRNA在人类和抑郁症动物模型外周血中的表达出现异常。Mi RNA与抑郁症的关联性研究已经被广泛报道。既往研究发现,抑郁症患者血清中miR-182-5p表达上调,与脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）负性相关。动物研究也发现,慢性不可预知温和刺激（chronic unpredictable mild stress,CUMS）大鼠海马中miR-182-5p的上调与BDNF的减少有关,且双荧光素酶实验证实BDNF可与miR-182-5p靶向结合。但是,这些研究并未明确miR-182-5p靶向结合BDNF具体通过何种表型影响抑郁症,以及circRNA是否可以作为miR-182-5p海绵参与抑郁症发病。BDNF是一种多肽生长因子,其信号通路参与抑郁症的发病。BDNF表达和信号传导下降,可损害或阻碍神经可塑性,促进神经元萎缩、突触数量和功能下降,从而诱发抑郁样行为。突触素（synaptophysin,SYP）、生长相关蛋白43（growthassociated protein 43,GAP43）和突触后致密蛋白95（postsynaptic density protein 95,PSD95）是与突触传递密切相关的蛋白,它们在抑郁症和抑郁动物模型中表达降低,治疗后增加。海马参与情绪调节,是抑郁症发生的关键脑区。先前的研究发现,抑郁症的神经可塑性损害,特别常见于海马。鉴于circRNA的结构稳定性、miRNA海绵作用和其与抑郁症的关系,我们欲研究circRNA在抑郁症中的表达及作用,以及circRNA是否通过miR-182-5p/BDNF轴调节突触可塑性在抑郁症中发挥作用。我们的研究分以下三部分进行。第一部分抑郁症患者外周血circPTK2表达水平的研究目的:明确MDD患者临床特征、外周血circRNA表达水平,筛选差异表达的circRNA。评估circRNA对抑郁症的鉴别能力,分析其与病情严重程度、自杀倾向的关系。方法:收集2020年06月24日-2021年04月21日就诊于长春市第六医院心理门诊的成年MDD患者为病例组,另招募2020年09月16日-2021年03月30日于吉林大学第一医院体检的健康体检者为对照组。MDD由两位精神病学医师根据DSM-5诊断,病例组和对照组均符合纳入标准。收集受试者的社会人口学资料和病史资料,并采集受试者晨起空腹静脉血2ml,分离外周血单个核细胞。荧光定量PCR检测抑郁症患者和对照组外周血单个核细胞中circRNA的表达,筛选显著表达的circRNA。受试者工作特性（receiver operating characteristic,ROC）曲线评估circRNA对抑郁症的鉴别能力,分析circRNA与抑郁症病情严重程度、自杀倾向的关系。结果:共纳入MDD患者50例,年龄、性别匹配的健康对照40例。MDD平均发病年龄为31.86岁,成年早发（18-44岁）的患者有41人（82.0%）。抑郁症多发生于女性（62.0%）,学生在18岁以上患者中占据一定的比例（18.0%）。患者往往有较高的文化水平和较高的非独生子女比例。24项汉密尔顿抑郁量表（24-item Hamilton Depression Scale,HAMD-24）评分平均值是40.60分,有60.0%的患者为严重抑郁,80.0%的患者有自杀倾向。汉密尔顿焦虑量表（Hamilton Anxiety Scale,HAMA）平均值为25.86分,明确有焦虑的患者有47人（94.0%）。生物信息学分析发现人类circ USP42（hsa＿circ＿0007823）、circPTK2（hsa＿circ＿0002483）和circ KIAA0907（hsa＿circ＿0000140）与人类miR-182-5p靶向结合,且他们都存在小鼠的同源序列（注:同源的小鼠circRNA也能够与小鼠miR-182-5p靶向结合）。实时荧光定量PCR发现,与对照组（n=24-25）相比,MDD患者（n=31）外周血中circPTK2和circ KIAA0907的表达显著降低,而circ USP42的表达无明显降低。ROC曲线分析发现,circPTK2对MDD的鉴别能力优于circ KIAA0907。我们选择3个circRNA中表达差异最大、丰度最高,对MDD鉴别能力更好的circPTK2进行后续研究。样本量扩大后,MDD患者（n=50）circPTK2的表达仍显著低于对照组（n=40）。ROC曲线发现circPTK2对抑郁症有良好的鉴别能力。相关性分析发现,circPTK2的表达与HAMD-24、HAMA得分无相关性,但与HAMD-24评估中认知障碍因子的自杀和日夜变化因子负性相关。结论:Circ PTK2和circ KIAA0907在MDD患者中的表达显著降低。Circ PTK2参与抑郁症发病,可能是抑郁症的外周生物标志物。第二部分CUMS小鼠抑郁模型建立及行为学分析目的:明确CUMS小鼠抑郁模型建立是否成功,抑郁样行为持续时间,评价行为学测试在CUMS中的适用性,并选择合适的行为学评估方法。方法:将C57BL/6小鼠随机分为CUMS组和对照组。CUMS组小鼠随机暴露于各种低强度的社会和环境刺激下,每天2-3次,持续4周。对照组小鼠正常饲养,不给予任何处理。CUMS造模结束后分别对两组小鼠进行为期1-3周的行为学测试,观察造模结果及抑郁症状持续时间。行为学测试包括:蔗糖消耗实验（sucrose consumption test,SCT）,计算蔗糖摄入量占总液体摄入量的比例;新奇抑制摄食实验（novelty suppressed feeding test,NSFT）,记录小鼠的摄食潜伏期和5分钟摄食量;悬尾实验（tail suspension test,TST）,计数后4分钟内小鼠的不动时间;被迫游泳实验（forced swimming test,FST）,计数后4分钟内小鼠的不动时间;开放旷场试验（open field test,OFT）,统计5分钟内小鼠的运动总距离（或平均速度）和中心区域停留时间。结果:CUMS造模结束后,共有10只CUMS小鼠、7只对照组小鼠进行为期3周的行为学测试。CUMS造模后1周,两组小鼠在TST、NSFT 5分钟摄食量、OFT总距离和中心区域停留时间、SCT均无统计学差异。但是,CUMS小鼠在NSFT中的摄食潜伏期和FST中的不动时间均长于对照组小鼠。CUMS造模后2周,CUMS小鼠的NSFT摄食潜伏期和FST不动时间仍长于对照组。另外,CUMS小鼠的NSFT 5分钟摄食量少于对照组。然而,两组小鼠在TST测试中仍无统计学差异。CUMS造模后第3周,两组小鼠的TST、NSFT摄食潜伏期、OFT总距离均无统计学差异,在OFT中心区域停留时间上接近统计学差异。CUMS小鼠比对照组小鼠的NSFT 5分钟摄食量更少,FST不动时间更长,SCT蔗糖摄入量更少。结论:我们成功建立了CUMS小鼠抑郁模型,而且小鼠抑郁样行为可持续3周以上。FST、OFT、NSFT适用于CUMS小鼠行为评估,而SCT、TST不适用。第三部分circPTK2在小鼠抑郁模型中的作用及机制研究目的:检测circPTK2、miR-182-5p、BDNF以及突触可塑性相关蛋白在CUMS小鼠海马中的表达水平。明确circPTK2是否通过circPTK2/miR-182-5p/BDNF轴调节海马突触可塑性参与抑郁症发病。方法:C57BL/6小鼠随机分为CUMS组和对照组,行为学实验评估两组小鼠行为。荧光定量PCR检测CUMS小鼠和对照组小鼠海马组织中circPTK2（mmu＿circ＿0005779）、miR-182-5p表达水平。通过ROC曲线评估circPTK2对小鼠抑郁样行为的辨别力,分析circPTK2与行为学结果的相关性。RNase R和放线菌素D实验明确circPTK2的稳定性。构建circ Control-增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）和circPTK2-EGFP AAV,通过立体定位注射技术注射于C57BL/6小鼠海马。3-4周后,待AAV基因转录表达达到高峰时,免疫荧光染色观察海马注射位置是否正确及AVV是否与神经元细胞共定位。荧光定量PCR检测circPTK2-EGFP AAV是否过表达circPTK2。在CUMS小鼠和对照组小鼠海马立体定位注射circ Control-EGFP AAV和circPTK2-EGFP AAV前后,行为学实验观察各组小鼠行为。AAV注射后,荧光定量PCR检测miR-182-5p的表达,双荧光素酶实验验证circPTK2与miR-182-5p的靶向结合。蛋白质免疫印迹（Western Blot）检测BDNF、SYP、GAP43和PSD95的表达。结果:在CUMS刺激开始前,CUMS组（10只）和对照组小鼠（8只）体重无差异。CUMS刺激开始后第1周、第2周、第3周、第4周,CUMS小鼠的体重均低于对照组小鼠。CUMS刺激结束后,行为学测试发现CUMS小鼠的NSFT摄食潜伏期、FST不动时间显著长于对照组小鼠。荧光定量PCR发现CUMS小鼠海马中circPTK2的相对表达显著低于对照组小鼠,而miR-182-5p的相对表达则显著高于对照组小鼠。ROC曲线分析显示,circPTK2对小鼠抑郁样行为具有良好的鉴别能力。但是,circPTK2的相对表达与FST不动时间、NSFT摄食潜伏期无相关性。稳定性实验发现,circPTK2比PTK2 m RNA更耐受RNase R;随着放线菌素D处理时间的延长,PTK2 m RNA的表达逐渐降低,而circPTK2略有富集。AAV海马立体定位注射的免疫荧光染色显示,circ Control-EGFP和circPTK2-EGFP AAV小鼠均可见EGFP（绿色）在海马中广泛表达,并且都与神经元细胞（红色）存在共定位现象。海马组织的荧光定量PCR表明,circPTK2-EGFP小鼠circPTK2表达水平显著高于对照组小鼠。海马立体定位注射AAV前,CUMS小鼠的FST不动时间显著长于对照组小鼠。Circ Control-EGFP AAV和circPTK2-EGFP AAV注射后3-4周,CUMS小鼠FST不动时间较对照组小鼠仍明显增加,给予circPTK2 AAV后不动时间较给予circ Control AAV的CUMS小鼠明显减少。CUMS小鼠OFT的平均速度较对照组小鼠减慢,过表达circPTK2后平均速度增加。双荧光素酶实验证实,circPTK2可与miR-182-5p靶向结合。荧光定量PCR发现CUMS小鼠海马中miR-182-5p的表达显著增加,微量注射circPTK2 AAV后miR-182-5p表达降低。Western Blot实验发现CUMS小鼠海马中BDNF的表达水平较对照组显著下降,过表达circPTK2后BDNF的表达水平明显上升。另外,CUMS小鼠海马组织中SYP、GAP43和PSD的表达也明显降低,过表达circPTK2后其表达水平显著增高。结论:CUMS小鼠海马组织中circPTK2表达降低,过表达circPTK2可改善小鼠抑郁样行为。Circ PTK2通过miR-182-5p/BDNF轴调节海马突触可塑性改善抑郁样行为。