RNase P是一种核蛋白复合物,它可以在体内特异性地剪切tRNA前体（ptRNA）的5’末端,形成成熟的tRNA。大肠杆菌来源RNase P包括一个377nt的RNA催化活性单位（M1 RNA）和一个约119氨基酸的碱性蛋白（C5）,二者均为RNase P体内活性所必须。在缺乏C5蛋白的体外环境下,M1 RNA可在高盐溶液中具备对底物RNA进行催化切割的活性。外部引导序列（External Guide Sequence,EGS）是能与底物mRNA互补的小片段RNA,只要二者形成类似ptRNA分子的复合物,M1 RNA即可对该复合物双链互补区域进行特异切割。 本课题以人类巨细胞病毒（HCMV）UL54基因mRNA片段为靶序列,从13个适合EGS互补的靶序列中,选择4个已经证明可以被M1GS核酶特异切割、并且切割活性较高的靶序列作为研究对象,设计特异性与靶序列部分互补形成茎环结构的EGS,研究M1 RNA在EGS引导下对UL54基因mRNA片段的切割作用。EGS与M1 RNA、底物均由T7启动子起始转录,分别获得RNA-based EGS、M1 RNA和α-³²P_UTP放射性标记的底物RNA片段。将底物RNA片段、M1 RNA与对应的RNA-based EGS在特定的体外切割缓冲液中混合反应,通过同位素扫描筛选到3个具备特异切割活性的RNA-based EGS。改变EGS的化学性质,人工合成4个与RNA-based EGS序列相同的DNA-based EGS,筛选出相同的3个具备特异引导切割的活性。 采用不同的Mg²⁺浓度进行体外切割反应,100mmol/L MgCl₂和200mmol/LMgCl₂时切割效率无显著差异,表明切割反应对Mg²⁺浓度的要求可能有更低的域值。 我们的研究成功利用两种不同化学性质的EGS引导大肠杆菌来源RNase P催化亚单位M1 RNA,实现了对HCMV UL54基因mRNA片段的特异性切割,并筛选出若干有效的EGS,为RNase P/EGS技术的胞内研究奠定了基础,证实了RNase P在抗病毒方面的应用价值。