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目的:衰老广义上被认为是时间依赖性引起的功能下降。肾脏也随着衰老发生相关改变,如肾皮质的变薄、肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管萎缩以及肾血管硬化。同时衰老细胞对自身微环境的影响,如衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype, SASP)也对加速衰老进程具有重要意义。限制饮食摄入(dietaryrestriction,DR)已被证明是一种延缓衰老的有效干预方式。机制涉及增加自噬、减轻炎症和氧化应激、增加胰岛素敏感性、上调SIRT1等。同时,降低特定营养素的摄入量,而非整体的热量,也发挥着保护作用,尤其以限制蛋白质和特定的氨基酸发挥作用更为突出。限制饮食中蛋氨酸(methionine restriction,MR)摄取可通过提高健康代谢标志物、限制脂肪堆积、增强胰岛素敏感性,从而对机体产生保护作用。已有研究表明MR可以延长果蝇、小鼠等动物模型的寿命,但具体分子机制尚不明确。其他学者的研究显示,DR引起的内源性硫化氢(H2S)增多是发挥保护作用的关键分子,而以蛋氨酸为主的含硫氨基酸恰恰是H2S在体内合成的重要来源。在本研究中,我们通过观察20月龄C57雄性小鼠自由饮食(Ad libitum,AL)及限蛋氨酸(MR)饮食后肾脏衰老标志物及SASP (IL-1、IL-6、IL-8)的改变,明确限制饮食中蛋氨酸摄取能否通过提高内源性H2S表达发挥延缓肾脏衰老的作用。并对机制进行深入研究,检测了 SASP的相关信号通路AMPK/mTOR的表达水平,探究H2S对该通路的调控作用。本研究对于探索延缓衰老相关肾脏疾病新的治疗方案具有重要的意义。方法:将12只SPF级C57BL/6雄性小鼠,正常条件喂养至20月龄后随机分为2组:①老年限蛋氨酸组(old methionine restriction,OMR):蛋氨酸限制至0.15%,胱氨酸缺乏(n=6);②老年对照组(old ad libitum, OAL):正常自由饮食(n=6);两组间其他条件相同且单位重量的饲料所含总热量一致。取6只2月龄SPF级C57BL/6雄性小鼠作为青年对照组(young ad libitum, YAL)。2个月后处死小鼠并留取小鼠肾脏病理及分生标本,检测动物生化指标。Western blot及ELISA检测SASP相关蛋白含量。体外实验中,用硫酸吲哚酚(Indoxyl sulfate,IS)诱导人肾小管上皮细胞衰老,将细胞分为3组:①对照组(DMEM)、②IS组(DMEM+250μM IS)、③IS+MR组(250uMIS+蛋氨酸6mg/L、缺乏胱氨酸的DMEM),刺激48小时后收集细胞及其上清液,Western blot及ELISA检测相关蛋白含量。免疫荧光检测SASP成分IL-1β、IL-8。体内外实验中我们均对各组AMPK/mTOR信号通路的表达情况进行了检测。随后我们为了验证AMPK/mTOR通路的关键作用,在培养基中加入AMPK抑制剂Compound C,刺激48小时后收集细胞及其上清液,Western blot及ELISA检测相关蛋白含量。结果:1)体内动物实验显示,OAL组小鼠肾脏出现明显肾小球硬化、肾小管间质损伤、肾小管萎缩及空泡变性、炎症细胞浸润等病理改变,而OMR组改变较轻,说明MR可在一定程度上延缓肾脏衰老相关改变。Western blot结果显示,与OMR组相比,OAL组小鼠肾脏中的H2S合成相关酶CGL降低,衰老相关标志物p16、p53、p21显著升高,磷酸化AMPK下降、mTOR及下游4E-BP1磷酸化水平明显升高,说明OMR可降低衰老肾脏中衰老标志物表达并激活AMPK通路。2)ELISA显示OMR组较OAL组血液中H2S含量升高,肾脏组织中IL-1β、IL-6水平降低。3)生化结果显示白蛋白、肌酐及相关指标组间无统计学差异,但OMR组血糖(7.13± 0.48mmol/L)及胆固醇(2.47± 0.36 mmol/L)较 OAL 组的血糖(11.36±1.67mmol/L)与胆固醇(3.61±0.36mmol/L)下降明显。4)体外实验显示,与对照组相比,IS组衰老标志物p53、p21的表达增加且β半乳糖苷酶染色阳性细胞增多,证实了IS对于衰老的诱导作用。而IS+MR组比IS组H2S合成相关酶CGL显著升高,衰老标志物p53、p21显著降低,磷酸化AMPK增多、mTOR及4E-BP1磷酸化显著降低。5) ELISA显示IS+MR组细胞中H2S含量显著升高,细胞培养上清中IL-1 β、IL-6显著降低。6)免疫荧光显示IL-1 β与IL-8在IS+MR组明显下降。7)在加入AMPK抑制剂Compound C后,IS+MR+CC组较IS组比较,虽H2S合成相关酶CGL依旧有所上升,但两组间衰老标志物及AMPK/mTOR关键蛋白表达量以及IL-1 β、IL-6表达均无明显差异,MR的保护作用减弱,提示AMPK/mTOR可能是H2S发挥作用的关键通路之一,H2S位于AMPK上游进行调控。结论:肾脏衰老过程中伴随着衰老标志物及SASP成分(IL-1β、IL-6、IL-8)表达增加。AMPK/mTOR在SASP的调节中具有重要作用,且H2S可对AMPK发挥调控作用。限蛋氨酸饮食可通过提高内源性H2S进而上调AMPK,抑制mTOR及下游4E-BP-1的磷酸化、减少肾脏衰老相关分泌表型的蛋白合成。本研究为今后延缓肾脏衰老可提供新的研究思路与并对肾脏衰老的防治具有重要意义。