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活性氧既能作为代谢副产物对植物造成氧化伤害,又能作为信号分子调控植物生长发育和逆境响应等过程。活性氧的双重作用取决于胞内活性氧的水平。植物体具有一套完善的活性氧产生和清除系统调控着胞内的活性氧稳态平衡。在正常的生长发育过程中,植物体内活性氧的水平处于稳态平衡。但是,一些逆境因子能打破活性氧的稳态平衡,对植物造成氧化胁迫。植物体内活性氧的稳态维持对植物正常的生理代谢过程具有重要的作用。1.活性氧稳态通过生长素信号路径调控棉花体细胞胚发生体细胞胚发生是体细胞向胚性细胞转变,经历与合子胚发育相似的阶段,最终再生成完整植株的过程。体胚发生不仅是研究合子胚胎发育的良好模型,也是植物遗传转化、植株再生的有效体系。为了阐明体胚发生过程中复杂的分子事件以及控制体胚发生的因子,我们通过蛋白组学结合MADI-TOF/TOF方法,来发掘调控棉花体胚发生的相关蛋白,并探索其可能存在的分子调控机制。通过双向电泳和质谱鉴定,我们比较了棉花体胚发生过程中具有代表性的时间点/阶段(0 h,2 d,NEC,EC,GE,TE,CE)的蛋白质组。与起始时期0 h相比,我们鉴定了149个差异表达的蛋白。GO分析表明,这些差异表达的蛋白主要参与胞内代谢、刺激响应以及生长发育和生殖等过程。一些逆境相关蛋白在棉花体胚发生过程中被激活且差异表达,主要包括一些活性氧清除相关的酶,如APX、GST、SOD和硫氧还蛋白等。q RT-PCR分析表明,大部分编码活性氧清除相关蛋白的基因,其在转录水平和蛋白水平具有一致的表达模式。我们对部分编码活性氧清除相关蛋白的基因进行干涉表达,以验证这些蛋白在棉花体胚发生中的作用。将Gh APXs在棉花中干涉表达后,Gh APXs干涉系中的过氧化氢含量显著高于野生型,Gh APXs干涉系的体胚发生起始和脱分化过程被显著抑制,而胚性细胞再分化过程被促进。同样,在棉花中干涉Gh GSTL3表达后,Gh GSTL3干涉系中的过氧化氢含量高于野生型,Gh GSTL3干涉系的体胚发生起始和脱分化过程与野生型相比无明显差异,但是Gh GSTL3干涉系的再分化过程显著提前。上述结果表明,这些基因可能通过调控活性氧稳态,进而参与棉花体胚发生的调控。我们进一步通过外源添加高浓度DPI、H2O2、BSO和GSH等化学物质,以改变内源氧化还原稳态,来观察氧化还原稳态对体胚发生的影响。结果表明,氧化还原稳态破坏抑制了体细胞脱分化过程,而氧化环境则促进了胚性愈伤向体胚的转变,进一步证实了活性氧稳态参与了棉花体胚发生的调控。DPI和过氧化氢处理均导致了自由态生长素含量降低、生长素代谢改变以及生长素运输和响应相关基因的激活。抑制Gh APXs表达,同样导致了体胚发生过程中生长素代谢改变,并且,生长素运输和响应相关基因的表达与野生型相比也发生改变。这个结果显示,无论是通过化学试剂还是通过抑制活性氧清除相关蛋白的表达来改变体内活性氧稳态,均会改变体胚发生过程中的生长素稳态平衡。我们的研究表明,体胚发生激活了逆境相关基因的表达,并通过活性氧稳态和生长素信号路径动态互作来调控棉花体胚发生。2.Gh TZF1通过抑制活性氧的积累来增强植株的耐旱性和延缓叶片衰老氧化还原稳态对植物维持胞内代谢至关重要。胞内氧化还原稳态的打破会导致细胞遭受氧化伤害进而抑制植物的生长发育。在细胞壁再生SSH文库中,我们分离得到一个CCCH型串联锌指蛋白基因。通过RACE的方法,我们获得该基因的全长,并通过结构分析和聚类分析发现,该基因具有植物特有的保守锌指结构域TZF,因而将该基因命名为Gh TZF1。表达模式分析表明,Gh TZF1在细胞壁再生的早期阶段优势表达。组织表达模式分析表明,Gh TZF1在营养器官和生殖器官中均有表达,且受叶片衰老诱导表达。此外,Gh TZF1受多种非生物逆境诱导上调表达,如PEG和Na Cl等,Gh TZF1同样受茉莉酸甲酯和过氧化氢的诱导表达。在拟南芥中超表达Gh TZF1,增强了植株的耐旱性并延缓了干旱诱导的叶片衰老。进一步的实验表明,超表达Gh TZF1同样能延缓黑暗和茉莉酸甲酯诱导的叶片衰老。在干旱和茉莉酸甲酯处理下,超表达系中过氧化氢的含量均显著低于野生型。与此一致,在干旱处理条件下,活性氧清除相关的酶,如SOD和POD,其在超表达系中的酶活显著高于野生型。q RT-PCR分析表明,干旱条件下,一些氧化相关的衰老相关基因在Gh TZF1超表达系中的表达量低于野生型。进一步实验表明,超表达Gh TZF1增强了植株对氧化胁迫的耐受性。在过氧化氢处理下,超表达系中活性氧清除相关基因的表达高于野生型,衰老相关基因的表达则低于野生型。因此,我们推测,Gh TZF1可能通过调控细胞内活性氧平衡来调控植株对干旱的耐受性以及叶片衰老过程。