论文部分内容阅读
研究背景肝纤维化由各种原因引起的慢性肝损伤后的机体过度修复反应所致,因其过多的细胞外基质的沉积将进一步使肝脏结构破坏导致肝硬化,引起肝功能损害和门静脉高压,进一步进展可引起肝功能衰竭和原发性肝癌¨。因此探讨肝纤维化的发生机制及防治方法具有重要的社会价值和经济意义。肝纤维化的转归是双向性的,一些研究报道认为即使是进展期的肝硬化也可能逆转。然而目前还没有公认的特别有效的逆转肝纤维化药物。因此,肝纤维化治疗是肝脏病研究的重点和难点。近年来的研究证实,肾素血管紧张素系统(RAS)与肝纤维化发生、发展密切相关。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)作为RAS的一个重要效应分子,通过激活肝星状细胞、汇管区的成肌纤维细胞及骨髓源性间质细胞等诸多致肝纤维化的潜力细胞,进而促进肝纤维化的发生、发展。现有研究认为肝星状细胞在肝纤维化形成中起主要作用,现有的关于AngⅡ的研究多集中在其对肝星状细胞活化和增殖机制上的探讨。但遗憾的是,虽然一些关于肝纤维化中星状细胞活化与胶原沉积相关具有相关性,但是未见有针对组织纤维化进程甚而逆转纤维化的实质性治疗的突破。虽然也有一些研究表明肝细胞可以合成胶原,但多认为肝细胞在肝纤维化进展中不起主要作用。上皮间质表型转换(epithelial-mesenchymal-transition, EMT)是指上皮细胞失去了其上皮特征性表型,获得了间质细胞如成纤维细胞样的形态。以前的研究多半认为EMT在胚胎发育及肿瘤进展及迁徙中是必不可少的。现已发现,肝内三种细胞如肝细胞、胆管上皮细胞和静息性HSC(Q-HSC)均可经EMT获得成纤维细胞的表型并具有成纤维细胞的重要功能,这和以往的观念有很大不同。2007在波兰召开的的一次有关EMT的会议及随后2008年的Cold Spring Harbor Laboratories均将EMT分为三种类型：Ⅰ型EMT参与胚胎发育和器官形成；Ⅱ型EMT参与创伤愈合、组织再生修复和器官纤维化；Ⅲ型EMT与肿瘤的侵袭转移有关。Ⅱ型EMT是一个与炎症和修复相关的事件,随炎症反应减弱和修复作用的完成而终止；一旦炎症反应持续存在或加重,Ⅱ型EMT可持续进行,导致大量的成纤维细胞增生和器官纤维化形成。有研究认为EMT是肝内成纤维细胞来源的重要方式。美国肝病学会主席Friedman SL在Gastroenterology上撰文认为,肝细胞经EMT转化为成纤维细胞是近年来肝纤维化研究的重要发现。本研究首次观察促纤维化因子AngⅡ诱导人肝细胞发生EMT,及发生EMT的相关机制,深入探讨AngⅡ对肝细胞中ERK、RhoA-Rock信号通路的影响,以探讨RAS促肝纤维化形成的分子机制。目的探讨血管紧张素II(angiotensinⅡ, AngⅡ)诱导人肝细胞HL-7702(人正常肝细胞系)上皮间质表型转换(EMT)的影响及其作用机制。方法常规培养HL-7702细胞,根据不同实验目的进行下述不同的实验：1、不同浓度的AngⅡ分别刺激肝细胞72 h后,Western Blot检测细胞中Albumin、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化；分为对照组、10-6mol/LAngⅡ处理组、10-7mol/L AngⅡ处理组；2、10-7mol/L Ang II分别于不同时间点处理肝细胞,Western Blot检测肝细胞中Albumin、vimentin、E-cadherin蛋白表达水平的变化；分为：24 h对照组、AngⅡ处理24 h组、48 h对照组、AngⅡ处理48 h组、72 h对照组、AngⅡ处理72 h组；3、免疫荧光法观察Albumin、vimentin、E-cadherin、一型胶原蛋白表达水平的变化及TRITC标记的鬼笔环肽染色后肝细胞中F-actin(纤维肌动蛋白)。分组为：对照组、10-7mol/L AngⅡ组,培养72 h；4、Western Blot检测肝细胞中Albumin、vimentin、E-cadherin、Ⅰ型胶原蛋白表达水平的变化；实时定量PCR法从基因水平定量检测各组肝细胞中Ⅰ型胶原、snail-1 mRNA表达水平的变化。分组为：(1)对照组,(2) TGFβ1 (Transforming Growth Factor-β1)组,(3) 10-7mol/L AngⅡ组,(4) AngⅡ+ irbesartan组(AngⅡ的ATl受体拮抗剂)、(5)AngⅡ+Y27632组(Rho-ROCK通路抑制剂),(6) AngⅡ+PD98059 (ERK通路抑制剂)组。其中10-5mol/L irbesartan、10-5mol/L Y27632、10-5mol/L PD98059先预处理1h,之后加入10-7mol/L AngⅡ处理72h。结果1、与对照组相比,AngⅡ处理肝细胞72h后,细胞中Albumin、E-cadherin表达显著减少(P=0.000,P=0.000),与10-7mol/L AngⅡ相比,10-6mol/L AngⅡ组肝细胞中Albumin、E-cadherin表达较多(P=0.004,P=-0.002)；AngⅡ处理肝细胞72h后细胞中vimentin表达较对照组增多,与10-7mol/L AngⅡ相比,10-6mol/L AngⅡ组肝细胞中vimentin表达较少(p=0.000,P=0.000)；2、分别与相对应时间点的对照组相比,10-7mol/L AngⅡ分别处理肝细胞24h、48h、72h后,Albumin、E-cadherin于72h减少(P=0.012,P=0.049),而vimentin于24h开始增加(P=0.000),48h增加明显(P=0.000)；3、免疫荧光法可见,经TRITC标记的鬼笔环肽染色后,对照组肝细胞中的F-actin主要分布在细胞之间的连接处,在细胞膜周围分布,与对照组相比,AngⅡ组肝细胞骨架结构重排,形态上呈梭形,获得纺锤样形态,细胞内遍布F-actin, F-actin张力丝呈极性。与对照组相比,免疫荧光显微镜下可见AngⅡ刺激肝细胞72h后肝细胞形态变为梭形,细胞中的Albumin、E-cadherin蛋白表达减少,而vimentin、一型胶原表达增多。4、与对照组相比,AngⅡ组、TGF-β1组Albumin、E-cadherin蛋白表达减少,vimentin、Ⅰ型胶原蛋白表达增加,与AngⅡ组相比,AngⅡ+irbesartan组、AngⅡ+Y27632组、AngⅡ+PD98059组Albumin、E-cadherin蛋白表达增加,vimentin、Ⅰ型胶原蛋白合成减少,差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比,AngⅡ组、TGF-β1组Ⅰ型胶原mRNA表达显著增加(P<0.05),AngⅡ+irbesartan组比AngⅡ组的表达显著减弱(P<0.05),差异有统计学意义(P<0.05)；与对照组相比,AngⅡ组snail-1 mRNA表达显著增加(P<0.05),与AngⅡ组相比,AngⅡ+irbesartan组、AngⅡ+Y27632组、AngⅡ+PD98059组snail-1 mRNA表达减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论Ang-Ⅱ可诱导肝细胞发生EMT,该诱导作用可被AT1受体阻滞剂irbesartan所阻断,该效应可能通过Rho-Rock信号通路、ERK通路所诱导。