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目的 种子细胞的培养是组织工程的基本要素。研究种子细胞的目的在于获取足够数量的接种细胞，同时保持细胞增殖、合成基质等生物功能并防止细胞老化。成骨细胞(osteoblast，OB)是骨组织工程的种子细胞，然而组织工程骨修复骨缺损的基础依然是它的血管化。如能将OB与血管内皮细胞(Vascular endothelial cells，VEC)联合培养，使其既能促进OB的增殖活性、又能加速组织工程骨再血管化进程，将有助于增强组织工程骨修复骨缺损的能力。组织工程的基本培养方法是将体外培养的、高浓度的组织细胞扩增后吸附于一种生物相容性良好，并可被人体逐渐降解吸收的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)上，种植的细胞在生物支架逐步降解吸收过程中，继续增生繁殖，形成了新的具有其原来特殊功能和形态的相应组织和器官，达到修复创伤和重建功能的目的。随着社会的飞速发展，交通运输、机械化程度的不断提高，高速、高能量的创伤所导致严重复杂骨折，常引起骨缺损、骨折不愈合。自体移植由于骨源及供骨部位有限，同时自体组织塑型困难等缺陷，限制了其在临床的推广应用。同种异体骨移植有一定的免疫排斥反应，组织工程化骨为解决这一问题提供了一条新的途经。本实验采用自行研制的脱细胞猪肋骨，复合兔OB和VEC，构建组织工程骨植入动物体内，对其生物相容性进行体内、体外观察研究，探讨异种骨移植在体内成骨、修复骨缺损和再血管化的病理过程，为组织工程骨临床应用提供理论依据。 方法 1．组织工程种子细胞培养和细胞相容性研究 1 .1细胞培养 培养兔成骨细胞(osteoblast，OB)A组、血管内皮细胞(Vascular endo-thelial。ells，VEC)B组、OB与VEC联合培养C组。 1 .2观察指标 1 .2.1倒置相差显微镜观察 倒置相差显微镜下观察3组细胞形态和生长情况。 1 .2.2免疫细胞化学染色 I型胶原免疫细胞化学染色，鉴定OB。血管恤因子免疫细胞化学染色，鉴定VEC。 1 .2.3组织学观察 联合培养的细胞制作爬片。3天后分别做HE染色和M~n三色染色，观察两种细胞混合生长的情况。 1 .2.4碱性磷酸酶(砒日ine phosPhatase，ALP)活性检测 采用对硝基苯磷酸盐法，测定ALP活性，观察VEC对OB产生的ALP活性有无影响。 1.2.5四甲基偶氮哇盐(methythiazolyl tetr即泊liulnbro而de，MTT)法检测细胞活力 分析3组细胞生长和增殖情况。 2，异种骨脱细胞细胞外基质(acell公ar extlacenular matrix，AECM)对OB与VEC生物相容性研究 2.1制备异种骨AECM支架材料 新鲜猪肋骨经双氧水、氯仿/甲醇、TritonX一100进行脱脂、脱抗原和脱细胞处理，制备成异种骨AECM支架材料，进行扫描电镜观察。 2.2细胞与异种骨AECM复合 3组兔细胞分别与脱细胞猪肋骨复合，对异种骨AECM的生物相容性、抗原性和生物毒性进行观察、研究。 2 .3观察指标 2.3.1倒置相差显微镜观察 观察细胞与异种骨AECM的粘附，细胞在异种骨AECM孔隙内分布，细胞生长、分化和增殖情况。 2.3.2组织学观察 一3组细胞与异种骨AECM复合培养sd后，分别行皿、甲苯胺蓝及Mas-son三色法染色。观察生物相容性。 2.3.4扫描电镜观察 观察细胞在异种骨AECM上粘附、生长、增殖和基质分泌情况。 2.3.5流式细胞仪检测 3组细胞与材料在培养板中复合培养，于ld、3d、sd，、7d，各组分别取细胞材料复合物3根，消化收集细胞并计数，用流式细胞仪进行细胞周期和倍体水平分析，了解异种骨AECM对细胞有无毒性影响。 3.异种骨AECM复合细胞植人动物体内实验研究 3.IB记U(5一澳脱氧尿啼吮)标记细胞 用B川U对3组兔细胞进行标记，分别与脱细胞猪肋骨复合，制备成组织工程骨，进行体内骨缺损修复。 3.2动物实验 取体重为2.0一2.5公斤新西兰大耳白兔27只，分为3组，每组9只动物。切除兔双前肢1.scm长挠骨制成骨缺损动物模型，左侧植人异种骨AECM与各组细胞复合培养l周的组织工程骨，右侧植人异种骨AECM为对照。分别于3周、6周、12周取材，观察骨折愈合情况。 3 .3观察指标 3 .3.1大体形态观察 肉眼观察各时相组织工程骨在体内的发育和转归。 3 .3.2骨缺损X线检查 了解植人组织工程骨与周围正常挠骨的结合情况，以及骨缺损部位骨痴形成、变化和塑形。 3 .3 .3 Brdu标记细胞示踪检测 了解种子细胞在实验动物体内成活情况。 3 .3 .4常规组织学检查 各时相点取材，制作石蜡切片，现、甲苯胺蓝、Masson染色，观察异种骨移植在体内成骨、修复骨缺损和再血管化的病理过程。 3 .3.51型胶原免疫组化 了解各时相点各组细胞分泌I型胶原的情况。 3 .3.6图像分析 选取组织工程骨与正常骨交界部位，用图像分析仪，测量单位面积内的血管面积。4.统计学方法实验结果以均数土标准差表示，组间计量资料比较采用SPSS 10.0软件包行方差分析和q检验。结果 1.?