论文部分内容阅读
越来越多的研究报导长链非编码RNA（long nocoding RNA,lnc RNA）在多种肿瘤中被异常调控,可以通过与关键的表观遗传调控因子相互作用,在染色质动力学和基因调控中发挥重要作用,促进肿瘤恶性进展。截止目前,HOTAIR作为lnc RNA中的“明星”被研究的最为深入和广泛。其5’端结构域能与EZH2蛋白结合,募集PRC2复合体;3’端结构域能够募集LSD1复合体。通过把抑制蛋白复合体带到靶基因位点,使靶基因启动子区H3K27me3富集,从而抑制基因转录。本论文旨在研究能够特异性阻断HOTAIR与EZH2结合的小分子抑制剂,通过干扰HOTAIR对PRC2的募集,抑制HOTAIR在肿瘤中的作用,从而达到肿瘤靶向治疗的效果。本研究第一部分,我们首先利用3D结构模拟技术,对HOTAIR 5’端212-300bp和EZH蛋白进行结构模拟。利用分子对接技术,把模拟的HOTAIR-EZH2结构与小分子化合物结构进行对接,在美国癌症研究院小分子化合物数据库中进行高通量筛选,从而获得了7个自由能最低的候选化合物。接着利用化合物人工合成以及细胞毒性试验,对候选化合物初步筛选,确定了具有潜力的小分子化合物AC1Q3QWB（AQB）。另一方面,我们对TCGA pan-cancer数据库进行分析,发现乳腺癌和胶质母细胞瘤中,HOTAIR和EZH2的表达量最高,并进一步分析了表达高的亚型。之后,通过细胞毒性试验,我们发现在胶质母细胞瘤和乳腺癌中,HOTAIR和EZH2表达高的细胞对AQB更敏感,提示AQB的毒性机制可能依赖HOTAIR和EZH2的表达。本研究第二部分,我们利用定量PCR和Western Blot实验,发现AQB并不影响HOTAIR和EZH2以及PRC2核心组分的表达水平,但能使H3K27me3的整体水平在72小时后发生降低。而RIP实验结果发现,AQB能够特异性抑制HOTAIR和EZH2的结合,而不影响其它lnc RNA与EZH2的结合。Ch IRP实验进一步证明了低剂量的AQB即可明显降低HOTAIR-EZH2结合。Ch IP实验结果显示AQB处理乳腺癌和胶质母细胞瘤细胞系后,HOTAIR-PRC2靶基因启动子区EZH2、H3K27me3富集水平降低,而RNA pol II phospho-Ser2水平升高,提示靶基因转录活性增强。相一致地,我们发现靶基因的m RNA水平和蛋白水平都随着AQB处理浓度的升高而升高,并呈“S”型。这一部分结果表明AQB通过抑制HOTAIR-EZH2结合,使靶基因表达水平升高。在众多被AQB升高的靶基因中,我们用Ch IP和PCR实验方法,验证了APC2基因H3K27me3的修饰位点,并且可在AQB处理后水平明显下调。免疫荧光技术和Western Blot实验结果展示上调的APC2伴随着β-catenin和p-β-catenin水平降低。并且我们发现,EMT相关的β-catenin下游的基因和转录因子的蛋白水平也都降低。共聚焦显微镜分析发现,AQB处理后,胶质母细胞瘤和乳腺癌细胞的骨架蛋白F-actin丝状伪足减少,板状伪足增多,Vimentin和ZEB1的表达水平也都降低。在功能方面,低剂量的AQB（40n M）即可抑制肿瘤细胞的转移,而较高的剂量（40μM）可以抑制肿瘤细胞的克隆增殖,并促进凋亡和周期阻滞。在体内实验,通过构建乳腺癌原位模型,我们发现AQB（50mg/kg）能抑制乳腺癌原位增殖和肺转移。这部分结果表明AQB可以通过Wnt/β-catenin通路,抑制胶质母细胞瘤和乳腺癌增殖和转移。本研究第三部分,我们探索了AQB的联合治疗方案。AQB、DZNep以及AQB联合DZNep的IC50曲线显示AQB能够增强DZNep对肿瘤细胞毒性1.5倍～2倍。进一步的细胞活性分析发现,40n M AQB联合1μM DZNep可以使抑瘤效果达到甚至超过5μM DZNep的抑瘤效果。同样地,我们通过流式细胞检测仪也检测到40n M AQB联合1μM DZNep可以使促凋亡效果达到甚至超过5μM DZNep的促凋亡效果。Western Blot实验发现,联合用药也使靶基因的表达水平升高更明显。在体内实验,我们构建了乳腺癌原位模型和人胶质瘤来源的小鼠胶质瘤模型（PDX）,发现联合治疗比单药治疗更有效的抑制了肿瘤的增殖和转移。这部分结果表明,低剂量AQB可以增强DZNep的抑瘤效果。综上所述,本研究确定了一种特异性抑制HOTAIR-EZH2结合的小分子化合物—AC1Q3QWB。它可以干扰HOTAIR对PRC2的募集,降低靶基因H3K27me3水平,使靶基因表达上调。APC2作为靶基因之一,通过降解β-catenin,抑制Wnt/β-catenin通路,参与AQB对肿瘤增殖和转移的抑制。另外,低剂量的AQB可以增强EZH2抑制剂DZNep的抑瘤效果,为AQB的临床转化提供了联合用药方案。本研究首次报导了以长链非编码RNA与蛋白结合为靶点的小分子抑制剂,为肿瘤靶向治疗提供了新的方向。