研究背景和目的:胰腺癌是消化道恶性程度最高的肿瘤之一,病情进展迅速,治疗手段局限,在全世界范围内胰腺癌的发病率位列恶性肿瘤的第12位,死亡率位列恶性肿瘤的第7位,且其5年生存率不超过5%。胰腺癌的早期发现及诊断较为困难,目前没有可早期预警胰腺癌的具体症状及体征,并且缺乏可早期规范筛查胰腺癌的确切手段。时至今日,根治性手术仍是提供治愈胰腺癌的唯一希望,但预后仍令人失望,约85%的尚可进行外科手术的患者由于术前已有隐匿的转移或由于术后的复发转移至总生存时间不足五年,且这种转移的发生十分快速及不可预估,时常在筛查诊断和治疗之前就已经发生及发展。除此之外,基质细胞和ECM间质压力使血管收缩,减少了化疗化合物的流动,因此化疗药物的渗透作用有限,加之膜腺癌癌细胞对化疗药物不敏感,导致化疗效果很不理想。放疗虽然可以一定程度上缓解患者的疼痛,但是目前没有任何明确的证据表明其可以延长胰腺癌患者的总生存期。总而言之,胰腺癌的特点就是转移早、发现晚、预后差、易复发。而促使胰腺癌治疗困难,预后不良的主要因素就是在疾病发生的初级阶段就已经伴随了转移发生。因此,针对胰腺癌的上述行为特点,找到调控其恶性生物学行为的关键节点蛋白和调控通路,针对此蛋白开发新型靶向药物,或阻断其调控恶性生物学行为的相关信号通路,为胰腺癌患者提供新型的治疗方法,这对改善胰腺癌患者的不良预后是十分有意义且势在必行的。为了明确调控胰腺癌侵袭和转移的具体分子机制,在之前的研究中,我们使用BOP诱导叙利亚仓鼠,取产生胰腺癌的原位灶建立了非解离型胰腺癌细胞系(PC-1),再通过尾静脉注射的方式将PC-1细胞种植于另一只同种叙利亚仓鼠体内,并取肝转移灶以建立解离型胰腺癌细胞系(PC-1.0)。这两个胰腺癌细胞系是一对具有不同侵袭和转移能力的同源细胞系,其主要的区别在于:解离型胰腺癌细胞系(PC-1.0)具有较强的侵袭和转移能力,而非解离型胰腺癌细胞系(PC-1)具有相对较弱的侵袭和转移能力。这对同源的胰腺癌细胞系是较理想的研究胰腺癌侵袭转移的细胞模型,针对这对细胞进行差异蛋白质组学分析所得到的差异蛋白质与胰腺癌侵袭转移高度相关,针对这些差异蛋白进行深入研究可以更加靶向性地了解胰腺癌侵袭转移的相关机制。人胰腺癌细胞AsPC-1与解离型胰腺癌细胞系(PC-1.0)生物学特性相似,而人胰腺癌细胞Capan-2与非解离型胰腺癌细胞系(PC-1)生物学特性相似。针对仓鼠胰腺癌细胞系筛选出差异蛋白质及其在侵袭转移中的作用可通过在此对人胰腺癌细胞内进行验证。外泌体是细胞在正常及病理状态下向细胞外释放的40-150 nm的细胞外囊泡,首次于绵羊的网织红细胞中被发现,Johnstone于1987年将其命名为“exosome”。外泌体囊泡中包含有蛋白质,DNA,mRNA和非编码RNA。这些物质可能介导特定的细胞间通信,激活能与它们融合或相互作用的细胞中的信号通路。外泌体在肿瘤微环境中被检测到,许多近期研究证实,外泌体可参与促进肿瘤血管生成、上皮间质转化和免疫,进而促进癌细胞侵袭转移过程中发挥重要作用。循环血液中外泌体可作为无创性生物标志物,以提示相关肿瘤患者的初期血液筛查和术后复发预警。腱生蛋白C(TNC)作为细胞外基质糖蛋白家族的成员之一,在组织损伤修复和纤维化过程,炎症反应及部分肿瘤血管生成、转移有关中发挥着重要作用。TNC在人类正常组织中低表达或者不表达,但在许多恶性肿瘤中高表达。最近,TNC作为外泌体蛋白在恶性肿瘤中的作用受到广泛关注。尤其是外泌体来源TNC在胰腺癌早期诊断,是否伴有转移和预后判断方面的作用尚不明确。本课题拟对外泌体来源TNC在胰腺癌的发生发展及调控肿瘤恶性生物学行为方面的分子机制进行研究。研究方法:1、本次研究中,利用定量蛋白质组学(iTRAQ)对仓鼠胰腺癌细胞系PC-1.0和PC-1细胞上清液中的细胞外囊泡进行差异蛋白质组学分析,在蛋白质组学结果中选取在PC-1.0细胞中呈明显高表达的腱生蛋白-C(TNC)做进一步深入研究。利用ExoQuick-TC试剂盒提取PC-1.0细胞上清液中的外泌体蛋白,利用透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)对提取的细胞外囊泡进行外泌体形态学方面的鉴定,利用Western-blot对提取的外泌体进行蛋白标志物鉴定。通过Western-blot明确TNC是否为外泌体蛋白以及明确外泌体蛋白TNC在PC-1.0和PC-1,AsPC-1和Capan-2两对细胞系中的表达差异。2、在细胞实验研究中,用TNC-shRNA瞬时转染胰腺癌细胞系PC-1.0和AsPC-1,并采用实时定量PCR反应和蛋白免疫印迹两种方法验证沉默效率。在有效沉默TNC基因的条件下,采用CCK-8检测沉默TNC后PC-1.0和AsPC-1细胞增殖的变化情况;通过Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色后流式细胞仪检测沉默TNC后PC-1.0和AsPC-1早期及晚期凋亡的变化情况;通过Wound-healing检测沉默TNC后PC-1.0和AsPC-1细胞侵袭的变化情况;采用Transwell实验进一步验证沉默TNC后PC-1.0和AsPC-1细胞迁移和侵袭能力的变化情况。3、接下来,以便更深入探求TNC参与胰腺癌上述恶性生物学行为的所涉及的相关分子机制,我们采取蛋白免疫印迹方法明确了沉默TNC对NF-κB信号转导通路的影响。此外,还我们还利用蛋白免疫印迹方法探索外泌体TNC是否参与胰腺癌细胞的上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)和其与Wnt/β-catenin信号转导通路的关系,以揭示TNC在胰腺癌中发挥的生物学功能的可能分子机制。结果:1、透射电子显微镜结果显示视野中大多是略小于100nm的具有清晰膜的茶托样结构,提示应用ExoQuick-TC试剂盒提取PC-1.0细胞上清液中的囊泡结构为外泌体样结果。Western-blot结果显示,外泌体标记物蛋白CD81,CD63,HSP70均为阳性。这些均提示我们在PC-1.0细胞上清液中提取的物质为外泌体。在PC-1.0和PC-1,AsPC-1和Capan-2两对细胞系中外泌体TNC的表达有明显差异,对数据进行分析研究,外泌体TNC在侵袭能力较强的PC-1.0和AsPC-1两种细胞中呈明显的高表达,在侵袭能力相对较弱的PC-1和Canpan-2两种细胞中呈低表达。2、外泌体蛋白TNC在PC-1.0和AsPC-1两种细胞中呈相对高水平表达。应用shRNA瞬时转染上述两种细胞后能显著地下调外泌体TNC表达水平。细胞水平上,CCK-8实验检测下调外泌体TNC对细胞增殖能力的影响:PC-1.0和AsPC-1细胞敲减组比对照组NC细胞增殖能力减弱。PC-1.0细胞,72小时细胞增殖倍数shRNA瞬时转染组比NC组减低(2.880±0.097 vs 3.513±0.230,P<0.001),96小时细胞增殖倍数shRNA转染组比NC组减低(3.148±0.06 3 vs 4.020±0.0.080,P<0.001);AsPC-1细胞72小时细胞增殖倍数shRNA转染组比NC组减低(2.861±0.052vs 3.388±0.267,P<0.001),96小时细胞增殖倍数shRNA转染组比NC组减低(3.083±0.031 vs 4.318±0.162,P<0.001)。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒染色后流式细胞仪检测下调外泌体TNC对细胞凋亡的影响:PC-1.0和AsPC-1细胞敲减组比对照组NC凋亡率增加,其中对细胞早期凋亡影响不明显,对细胞晚期凋亡的影响有统计学意义,在PC-1.0和AsPC-1两种细胞中:P=0.0387,P=0.0119。Wound-healing实验检测下调外泌体TNC对细胞侵袭能力的影响:PC-1.0细胞,shRNA瞬时转染组比NC组侵袭能力减弱;AsPC-1细胞,shRNA瞬时转染组比NC组侵袭能力减弱。Transwell实验进一步检测下调外泌体TNC对细胞侵袭及迁移能力的影响:PC-1.0细胞,shRNA瞬时转染组比NC组侵袭细胞减少(227.667±13.283 vs 758.667±40.761,P<0.001);AsPC-1细胞,shRNA瞬时转染组比NC组侵袭细胞减少(310.000±17.436 vs 743.333±76.790,P<0.05);PC-1.0细胞,shRNA瞬时转染组比NC组迁移细胞减少(236.333±10.414 vs 735.000±23.643,P<0.0001);AsPC-1细胞,shRNA瞬时转染组比NC组迁移细胞减少(289.667±10.138 vs 723.000±56.454,P<0.05),综此结果表明:下调外泌体TNC减弱胰腺癌细胞迁移和转移的能力。3、在PC-1.0和AsPC-1两种细胞中,通过应用shRNA瞬时转染敲低胰腺癌细胞外泌体蛋白TNC,与原细胞TNC高表达的状态相比,NF-κB信号转导通路的变化:在细胞内总P65表达水平一致的情况下,核内pho-NF-κB-P65表达水平下调。在PC-1.0和AsPC-1两种细胞中,通过应用shRNA瞬时转染敲低胰腺癌细胞外泌体蛋白TNC,与原细胞TNC高表达的状态相比,Wnt/β-catenin信号转导通路的变化:胞内pho-β-catenin表达水平上调,同时Wnt/β-catenin信号转导通路下游相关靶基因表达水平下调。在PC-1.0和AsPC-1两种细胞中,通过应用shRNA瞬时转染敲低胰腺癌细胞外泌体蛋白TNC,与原细胞TNC高表达的状态相比,EMT相关标志物蛋白的表达表达水平的变化:E-cadherin表达水平上调,而N-cadherin和Vimenin表达水平下调。结论:1、在胰腺癌细胞系中,TNC是一种外泌体蛋白。作为外泌体蛋白TNC在侵袭能力相对较高的仓鼠胰腺癌细胞系PC-1.0和人胰腺癌细胞系AsPC-1的表达含量较高,而在侵袭能力相对较低的仓鼠胰腺癌细胞系PC-1和人胰腺癌细胞系Canpan-2的表达含量较低,说明外泌体TNC可能在胰腺癌细胞的侵袭转移调控中发挥一定作用。2、下调外泌体TNC可以抑制胰腺癌细胞的增殖,使细胞晚期凋亡率增加,但不影响胰腺癌细胞的早期凋亡。下调外泌体TNC可以抑制胰腺癌细胞的侵袭及迁移能力。下调外泌体TNC表达在改善胰腺癌恶性表型方面发挥重要作用。3、外泌体TNC参与调节NF-κB信号转导通路及Wnt/β-catenin信号转导通路的表达是其在胰腺癌中发挥生物学功能的可能分子机制。外泌体TNC参与调控胰腺癌细胞上皮间质转化。