论文部分内容阅读
内生微生物是植物微生态系统的重要组成部分,越来越多的研究表明,其可以通过特殊的植物-微生物相互作用,在影响药用植物质量和产量方面发挥重要作用。怀地黄是产自河南省焦作地区的著名道地药材,也是我国传统的大宗中药材之一,但目前关于怀地黄内生微生物群落多样性及与药材品质的相关性问题并不清楚。为系统了解怀地黄内生微生物的多样性特征,挖掘潜在的微生物资源并进行合理开发和利用,本研究采用Illumina高通量测序技术和功能基因芯片（Geochip）调查了来自焦作道地产区的4个怀地黄栽培品种（85-5、吨王、金九和北京3号）的内生微生物群落组成和功能基因多样性特征,确定了怀地黄内生系统的优势、核心微生物菌群,并解析了地黄药效成分与内生菌群的相关性特征;进一步通过传统分离方法筛选可培养内生菌,获得了一组具有固氮、溶磷解钾、合成植物生长素以及产生地黄药效成分梓醇和毛蕊花糖苷潜力的功能菌株,为利用内生菌改良药材品质提供菌种资源。本研究取得的主要研究结果如下:1.不同栽培品种怀地黄的内生微生物群落结构存在明显差异,但其根际土壤中微生物群落结构组成相似,只是相对丰度存在差异,说明怀地黄内生微生物群落组成受宿主植物的影响大于根际土壤环境对其的影响作用。总体而言,怀地黄内生优势细菌主要属于变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteriota）,具体包括罗尔斯顿菌属（Ralstonia）、假单胞菌属（Pseudomonas）、红球菌属（Rhodococcus）和贪嗜菌属（Variovorax）;内生优势真菌属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）,包括掷孢酵母属（Bullera）、枝孢属（Cladosporium）、链格孢属（Alternaria）、曲霉属（Aspergillus）、Heterophoma、Plectosphaerella和Gibellulopsis。怀地黄根际土壤中的优势细菌主要分属于放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和绿弯菌门（Chloroflexi）,常见属包括norank＿f＿＿Vicinamibacteraceae和norank＿f＿＿norank＿o＿＿Vicinamibacterales;根际优势真菌主要属于子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）和罗兹菌门（Rozellomycota）,包括被孢霉属（Mortierella）、Heterophoma和Gibellulopsis。进一步通过构建怀地黄内生及根际系统的微生物共发生网络图,确定其核心微生物菌群。结果表明:怀地黄内生系统的核心细菌包括Mycobacterium、Devosia、Sphingobacterium和Allorhizobium-NeorhizobiumPararhizobium-Rhizobium;核心内生真菌包括Fusarium、Chordomyces和Plectosphaerella。根际土壤中核心细菌为Agromyces、Sphingomonas、norank＿f＿＿norank＿o＿＿Subgroup＿7、norank＿f＿＿norank＿o＿＿norank＿c＿＿Acidimicrobiia、Bacillus和norank＿f＿Gemmatimonada ceae;根际核心真菌为unclassified＿o＿＿GS11、unclassified＿o＿＿Glomerellales和Neonectria。2.内生微生物与怀地黄药效成分的相关性分析表明,有9个属的内生菌与地黄两种药效成分梓醇和毛蕊花糖苷的含量具有显著正相关性,具体包括内生细菌中的Ralstonia、Pseudomonas、Rhodococcus和内生真菌中的Fusarium、Chaetomium、Trichoderma、Cladosporium、Penicillium、Didymella。3.通过功能基因芯片解析怀地黄内生微生物的功能基因特征发现,不同栽培品种怀地黄内生菌的功能基因组成具有相似性,同时在所有怀地黄内生菌中均检测到了与促进植物生长、提高植物抗逆性以及影响地黄药效成分合成相关的功能基因,包括微生物固氮基因（nif H）、调节无机磷迁移转换的基因（pho A）、抗氧化酶基因（sod＿Fe Mn、sod A、sod＿Cu Zn、sod＿nickel、cat＿bac和cat＿fun）、参与植物生长激素吲哚乙酸（IAA）合成的基因（ipya）、参与植物耐盐胁迫的谷氨酰胺合成酶基因（gln A）、促进地黄药效成分合成的基因（AACT＿Di C4HB、GGPP＿synthase和badh）。4.采用微生物分离培养的方法筛选怀地黄内生菌,获得206株内生细菌和58株内生真菌。经16S/ITS r DNA序列测定及BLAST比对,分离到的可培养内生细菌鉴定为Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria和Bacteroidetes门的14个属,其中以Bacillus和Pseudomonas为主;可培养内生真菌均鉴定为Ascomycota,主要以Talaromyces和Aspergillus为主。进一步测定所分离菌株的促生长能力以及药效成分产生潜力,结果显示:所筛选内生菌中89株具有固氮潜力,36株具有溶解利用无机磷的能力,14株具有解钾能力,55株可以产生IAA,12株具有合成梓醇的潜力,7株有合成毛蕊花糖苷的潜力。其中Klebsiella sp.strain Y5、Agrobacterium sp.strain WTB112同时具备上述4种促生性能,Bordetella sp.p23同时具有梓醇和毛蕊花糖苷合成潜力,上述内生菌株有望应用于怀地黄品质的人工改良研究。