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自交不亲和性是一种广泛存在于植物中的生殖隔离现象,它能够拒绝自我花粉的生长,却可以使非自我的花粉完成正常的授粉受精。苹果等蔷薇科植物属于配子体自交不亲和类型,在异花授粉条件下花柱S决定子基因编码的S-RNase进入到花粉管中,被花粉SCF复合体标记泛素并最终被26S蛋白酶体降解,从而导致异交亲和；而自我的S-RNase则不会被泛素标记,保持活性,降解花粉管的RNA,使花粉管生长受阻。但迄今为止,花柱S-RNase泛素化降解的研究只在矮牵牛、金鱼草等植物报道,在苹果等蔷薇科植物尚未见报道。本研究以‘金冠’苹果为试材,克隆了E3泛素连接酶—SCF复合体组分SKP1、Cullin1和F-box,在组织和单元型特异性研究的基础上,验证其互作关系,模拟体内泛素化系统,研究了SCF复合体能否泛素标记S-RNase,其主要结果如下：1.根据‘金冠’基因组和EST数据库,利用F-box motif结构域为诱饵,筛选得到19个F-box基因,基因组定位发现有10个位于17号染色体的端粒端,分布S-RNase两侧；其于9个分别位于2、8、10、12、15和16染色体上。2.根据苹果基因组信息设计特异引物和全长引物克隆获得19个F-box基因,‘金冠’叶片、花粉、花柱、子房、萼片和花瓣RT-PCR特异性分析发现,位于17号染色体的10个基因在花粉中特异表达；其余9个基因在检测的各个组织中都有表达。3.以16个基因型不同的苹果品种叶片为模板,利用17号染色体10个F-box基因的特异引物,PCR扩增,结果显示：只有4个基因具有单元型特异性。因此,我们将这4个基因分别命名为S2-MdSFBB1、S2-MdSFBB2、S2-MdSFBB3、S2-MdSFBB4;另外6个基因分别命名为S2-MdSFBL1、S2-MdSFBL2、S2-MdSFBL3、S2-MdSFBL4、S2-MdSFBL5、S2-MdSFBL6。4.与花柱S1-、S2-、S3-、S5-、S7-、S9-RNase酵母双杂交结果发现：S2-MdSFBB1只与S2-和S3-RNase互作,S2-MdSFBB2只与S7-RNase互作,而S2-MdSFBB3和S2-MdSFBB4则能与S3-、S5-和S9-RNase互作。另外,S2-MdSFBL2只与S3-RNase互作,S2-MdSFBL5只与S7-RNase互作,而S2-MdSFBL4则能与S1,S3,S5和S9-RNase互作。5.以保守结构域比对苹果‘金冠’基因组获得的SKP1-like基因设计全长引物,克隆获得3个基因,发现：2个基因具有8个片层和2个α螺旋,且C末端WAFE后多出7-9个氨基酸,另外1个基因N端缺失了140个氨基酸,WAFE之后的序列与前者不同。RT-PCR分析发现3个基因均在花粉中特异表达。利用同样的方法从‘金冠’基因组中获得了1个CUL1的同源序列,RT-PCR分析发现：该基因在花粉中特异表达,命名为MdCullin1。酵母双杂交和Pull down结果显示,只有1个SKP1-like既与S2-MdSFBB1-4又与MdCullin1互作。因此,认为该SKP1-like基因为苹果的SLF-interacting Skp1-like1基因,命名为MdSSK1。6.以保守结构域比对苹果‘金冠’基因组获得的SBP1基因设计全长引物,克隆获得1个带有RING-HC结构域的蛋白,与其它SBP1蛋白相同其C末端具有8个保守的半胱氨酸残基。RT-PCR分析发现：MdSBP1在苹果不同组织中均表达,且没有单元型特异性。酵母双杂交和Pull down结果显示：MdSBPl除与S2-、S3-RNase的高变区互作外,与全长及S2-MdSFBB1-4和MdCullinl均不互作。7.25μg ml-1His-S2-RNase培养花粉2h后的花粉管总蛋白S2-RNase多克隆抗体Western blot检测发现：有2条比S2-RNase分子量大的条带,认为S2-RNase已被标记泛素；体外诱导的MdSSKl、S2-MdSFBBl、MdCUL1蛋白按一定浓度混合后添加泛素与S2-RNase共同孵育Western blot检测发现有1条比S2-RNase分子量大的条带,认为模拟体内系统S2-RNase也被标记泛素；但体内体外标记泛素的个数不同。而MdSBP1与S2-MdSFBB1、MdCUL1共同孵育S2-RNase或者单独与S2-RNase孵育均不能将S2-RNase标记泛素。综合以上结果认为苹果花柱S-RNase能够被MdSSK1连接的SCF复合标记泛素。