【摘 要】
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抗微生物肽（Antimicrobial peptides,AMPs）作为生物体天然免疫屏障的先锋效应因子,可通过病原体诱导的免疫应答迅速合成,表现为广谱抗微生物活性,且两栖类皮肤中抗微生物肽的种类及数量最为丰富。本项目以东北地区两栖类代表物种东北林蛙（Rana dybowskii）为研究对象,构建其皮肤AMPs分泌型毕赤酵母表达系统,获得重组AMPs,进行抗菌活性鉴定,为筛选抗菌效果显著的新药候选
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抗微生物肽（Antimicrobial peptides,AMPs）作为生物体天然免疫屏障的先锋效应因子,可通过病原体诱导的免疫应答迅速合成,表现为广谱抗微生物活性,且两栖类皮肤中抗微生物肽的种类及数量最为丰富。本项目以东北地区两栖类代表物种东北林蛙（Rana dybowskii）为研究对象,构建其皮肤AMPs分泌型毕赤酵母表达系统,获得重组AMPs,进行抗菌活性鉴定,为筛选抗菌效果显著的新药候选分子以及探讨其作用机制奠定基础。 方法:本实验采用PCR技术在重组pMD18-T质粒上扩增AMPs基因,在基因两端引入酶切位点,首次利用AMPs前体中天然EKR序列设计成熟肽AMPs表达程序,PCR产物经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切,克隆入分泌型表达载体pPIC9K,PCR鉴定、DNA测序检测重组质粒,确定正确插入的重组真核表达载体。真核表达载体经LiCl转化和PEG1000转化导入毕赤酵母后涂于MD平板,挑取菌落,G418加压筛选多拷贝株,进行表型鉴定、PCR鉴定,确定获得正确插入的高拷贝重组酵母株。筛选优化重组酵母株培养条件,摇瓶培养,培养液经葡聚糖G-25层析脱盐、冻干,Bradford法检测重组AMPs含量,比浊法测定重组AMPs对标准质控G-大肠杆菌（E.coli）、G+金黄色葡萄球菌（Saureus）最低抑菌浓度（MIC）和协同效应。 结果:（1）获得六种正确插入的重组真核分泌型表达载体pPIC9K-DB1、pPIC9K-DB2、pPIC9K-DB3、pPIC9K-CS1、pPIC9K-CS2、pPIC9K-AM3;并成功获得AMP-DB2、AMP-CS2、AMP-AM3三种重组分泌型毕赤酵母高拷贝株,分别为5、11、1株;重组酵母摇瓶培养最优条件为0.5%甲醇,诱导36h。（2）重组AMP-DB2、AMP-CS2、AMP-AM3对G+S.aureus的MIC分别为7.44、14.88、14.88（mg/ml）,而对Ecoli的MIC则分别为59.52、29.76、59.52（mg/ml）;AMP-DB2与AMP-CS2的组合对G-E.coli的MIC比单独作用时分别降低至75%和50%,但重组AMPs对G+S.aureus无明显协同作用。 结论:本项目首次利用AMPs前体中天然EKR序列设计成熟肽AMPs表达载体,建立了东北林蛙皮肤成熟AMPs的分泌型毕赤酵母表达系统。并通过重组酵母诱导成功生成对G+和G-菌有抑杀作用的重组AMPs,对G-E.coli活性的抑制有明显协同作用。
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