茜草炭活血祛瘀功效物质基础研究

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茜草为茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根茎,性味苦,寒,归肝经,具有凉血通经、化瘀止血等功效。茜草炭由茜草经炒炭炮制而成,炒炭后寒性下降,涩性增加,止血作用增强,被视为中医临床化瘀止血之要药。与茜草比较,目前茜草炭的研究较少,对其化学成分与药理作用的研究均不够系统,茜草炭化瘀止血物质基础与作用机制尚不明确,并且茜草炭药理学研究多在正常动物身上进行,割裂了中医“病症”与中药及其炮制品之间的关联性,孤立地去评价药物。本论文以茜草炭提取物、极性部位、成分群为研究对象,借助急性血瘀模型探究茜草炭活血祛瘀功效;借助LC-Q-TOF/MS对茜草炭提取物、极性部位化学成分进行定性比较研究;运用SPSS相关性分析对茜草炭各提取物化学成分与药理指标进行关联性分析,推测茜草炭活血祛瘀可能的活性物质。论文研究内容主要包括一下几个部分:一、文献研究通过查阅国内外相关文献,从炮制工艺及质量研究、化学成分、药理作用、临床应用等方面对茜草炭的研究进展进行总结,从外观形态、血液流变学、血小板聚集功能、凝血功能、微循环系统、纤溶系统、血栓、病理切片等方面对急性血瘀模型评价体系进行总结,为本文研究方向、实验思路与方法提供了参考依据。二、茜草炭提取物对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效研究采用水提、醇提、醇提后水提、醇提+水提(复合提取)法对茜草炭标准饮片进行提取,制备茜草炭提取物。采用皮下注射盐酸肾上腺素结合冰水浴复制大鼠急性血瘀模型,以体外血栓湿重、干重、全血黏度、凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、血小板聚集率(PAG)、纤溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、纤溶酶源激活物(t-PA)、血栓素(TXB2)、6-酮-前列腺素(6-keto-PGF1α)等评价指标为导向,考察茜草炭提取物活血祛瘀功效。实验结果显示:茜草炭醇提物与复合提取物显著改善模型大鼠全血粘度、减轻血栓湿重与干重、缩短凝血时间、升高PAI-1与6-keto-PGF1α的量、降低TXB2的量(P<0.05、0.01),两者均能升高模型大鼠血小板聚集率,醇提物显著降低(t-PA)的量(P<0.05),但对FIB量影响不大;且复合物能显著升高t-PA的量(P<0.01),其中复合提取物对全血粘度、血栓湿重、干重影响优于醇提物,而醇提物对凝血时间的作用效果强于复合提取物;醇提后水提物与水提物对急性血瘀模型大鼠的影响弱于醇提物与复合提取物,两者均具有改善模型大鼠全血粘度、减轻血栓干重、缩短TT与PT、升高PAI-1与TXB2的量、降低t-PA量的趋势,显著缩短APTT、升高FIB与6-keto-PGF1α的量、减轻血栓湿重(P<0.05、0.01)的作用。茜草炭复合物对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效最显著,复合提取法是茜草炭发挥活血祛瘀功效的最佳提取方法。三、茜草炭极性部位对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效研究茜草炭标准饮片经复合提取后,浸膏采用系统溶剂提取法制备茜草炭石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水部位。采用与第二章相同的方法复制模型,测定相同指标考察茜草炭极性部位活血祛瘀功效。实验结果显示:正丁醇部位显著降低体外血栓干重,中、低切黏度,缩短PT、APTT,显著降低PAI-1、TXB2含量,升高 t-PA、6-keto-PGF1α含量,修复 t-PA/PAI-1、TXB2/6-keto-PGF1α调节失衡(P<0.05或P<0.01),乙酸乙酯部位显著降低体外血栓干重,缩短TT、PT、APTT,增加FIB含量,增加血小板聚集率,降低PAI-1、TXB2含量(P<0.05或P<0.01),石油醚部位显著降低中、低切黏度,修复t-PA/PAI-1、TXB2/6-keto-PGF1α调节失衡,作用程度不及正丁醇部位,缩短TT、PT、APTT,增加FIB含量,增加血小板聚集率(P<0.05或P<0.01),作用程度不及乙酸乙酯部位。水提取部位除了可显著修复t-PA/PAI-1、TXB2/6-keto-PGF1α调节失衡,对模型大鼠的其他环节作用较弱。茜草炭正丁醇部位对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效最显著,正丁醇部位是茜草炭发挥活血祛瘀功效的活性部位。四、茜草炭成分群对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效研究合并茜草炭乙酸乙酯与正丁醇部位浸膏,经硅胶柱层析,分离制备茜草炭成分群QCT-1~QCT-5。采用与第二章相同的方法复制模型,测定相同指标考察茜草炭极性部位活血祛瘀功效。实验结果显示:QCT-1、QCT-2能显著降低模型大鼠体外血栓湿重、干重(P<0.05或P<0.01),其他成分群作用不显著。茜草炭各成分群对模型大鼠中、高切黏度调节作用差;QCT-1、QCT-4、QCT-5均可显著降低模型大鼠低切黏度,其中QCT-1作用效果最强(P<0.05),QCT-2、QCT-3对模型大鼠血液高粘状态调节作用弱。QCT-1显著缩短模型大鼠TT、PT、APTT,作用效果强于其他成分群(P<0.05或P<0.01);QCT-2显著缩短模型大鼠PT、APTT,增加 FIB 含量与 PAG(P<0.05);QCT-3、QCT-4、QCT-5 显著缩短 PT(P<0.05),对TT、APTT、FIB、PAG影响不显著。茜草炭各成分群对模型大鼠PAI-1、TXB2调节不显著;QCT-1、QCT-3显著升高模型大鼠t-PA含量,其他成分群作用效果不显著;QCT-2、QCT-3、QCT-4显著升高模型大鼠6-keto-PGF1α含量,其他成分群作用效果不显著;模型大鼠t-PA/PAI-1、6-keto-PGF1α/TXB2两对因子调节失衡,QCT-1能显著修复这两对失衡因子(P<0.05),QCT-4能显著修复6-keto-PGF1α/TXB2调节失衡,其他成分群对上述两对因子调节作用不显著。QCT-1对急性血瘀模型大鼠活血祛瘀功效最显著,QCT-1是茜草炭发挥活血祛瘀效应的效应成分群。五、茜草炭各提取物化学成分LC-Q-TOF/MS定性分析采用LC-Q-TOF/MS对茜草炭四种提取物、四个极性部位化学成分进行定性比较研究。采用Peak View SoftwareTM质谱分析软件,应用XIC Manager插件中的数据筛选功能(Enhance peak list)进行数据分析。茜草炭提取物共鉴定化合物34种,水提物、醇提物、醇提后水提物、复合提取物分别鉴定出化合物27、34、24、34种;茜草炭极性部位共鉴定化合物32种,石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水提取部位分别鉴定出化合物23、32、26、15种,为茜草炭物质-功效相关性研究奠定基础。六、茜草炭提取物、极性部位化学与药理相关性分析基于“第二、三、五章”实验研究基础上,运用SPSS分析软件中的双变量相关分析得出与茜草炭发挥活血祛瘀功效的可能活性物质16个:2-羟基蒽醌、茜素、异茜草素、羟基茜草素、去甲虎刺醛、2-羧基-4-羟基蒽醌、茜草酸、1-羟基-2-甲基蒽醌、甲基异茜草素、1-羟基-3-乙基蒽醌、大黄素甲醚、1,4-二羟基-2-甲基-5/8-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基-2-羟甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-(6’-O-乙酰基)-吡喃葡萄糖苷、1,3,6-三羟基-2-甲基蒽醌-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基(1→2)-β-D-(3’/4’/6’-O-乙酰基)-吡喃葡萄糖苷。
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