论文部分内容阅读
背景:鼻咽癌系高度恶性的头颈部肿瘤,具有高度侵袭性、易出现远处转移。中国鼻咽癌发病率和死亡率分别占全球的38.29%和40.14%,并高发于广东、福建等南方地区,是一类危害国人健康的重大疾病。尽管联合放化疗对早期患者疗效明显,但70%-80%患者在确诊时已处于晚期,给予传统放化疗未能明显提高生存率。因此,寻找治疗新靶点以提高鼻咽癌疗效是亟待解决的难题。CyclinB1是一个关键的细胞周期蛋白,参与细胞周期的调控。目前在多种肿瘤中(包括鼻咽癌)均存在cyclinB1异常升高,并呈现出癌基因的特性,提示cyclinB1异常表达是恶性肿瘤发病的重要机制,有望成为肿瘤治疗的新靶点。自噬是细胞内自我消化的过程,其对肿瘤的影响具有双面性;一方面,在肿瘤早期自噬可抑制肿瘤细胞的生存。另一方面,在肿瘤晚期自噬可通过降解折叠错误蛋白或受损细胞器为肿瘤细胞提供能量进而保持内环境稳定。本论文将探讨下调cyclinB1对鼻咽癌细胞自噬的影响及其分子机制的研究,并探究靶向阻断cyclinB1作为鼻咽癌治疗新靶点的可行性。目的:探究下调cyclin B1对鼻咽癌细胞自噬的影响,揭示其对自噬信号通路的调控作用,并研究靶向阻断cyclinB1作为鼻咽癌治疗新靶点的可行性。方法:通过胸腺嘧啶核苷(TdR)双阻断法将鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2同步至S期;荧光显微镜及流式细胞仪检测CNE-1、CNE-2细胞siRNA转染效率,western blot检测下调效率;应用RFP-GFP-LC3双荧光标记、LC3免疫荧光、单丹磺酰尸胺(MDC)染色及透射电镜检测细胞自噬小体;Western blot检测自噬相关蛋白LC3-I、LC3-II和p62的表达;转录组测序检测下调cyclinB1后差异基因的表达;生物信息学分析差异基因信号通路的富集及其生物学功能;RT-PCR及Western blot进一步验证转录组测序结果;流式细胞术检测胞内ROS及线粒体mROS水平;化学发光法检测ATP水平;ROS抑制剂下调胞内ROS水平;siRNA下调AMPK的表达;肿瘤基因组图谱(TCGA)数据库分析cyclinB1在不同肿瘤中的表达及其与预后的关系;CCK-8及结晶紫实验检测鼻咽癌细胞增殖;Annexin V-FITC/PI及Tunel检测细胞凋亡;β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果:1.细胞周期同步化:经2.5mmol/L TdR诱导后细胞周期图形明显变化,流式细胞仪检测显示阴性对照组G0/G1期、S期、G2/M分期明显,而实验组82%细胞同步于S期,提示TdR双阻断法可有效地将细胞同步至S期。2.siRNA下调鼻咽癌细胞CNE-1、CNE-2 cyclinB1的表达:LipofectaminemRNAiMAX可有效地将荧光标记的FAM-siRNA转入CNE-1和CNE-2细胞。3条siNRA(siCB1、siCB2、siCB3)均可有效地下调cyclinB1的表达,尤以siCB2效果最佳(P<0.05)。3.下调鼻咽癌细胞cyclinB1的表达诱导自噬:Western blot显示实验组自噬相关蛋白LC3-II相比对照组表达升高而p62的蛋白水平下降(P<0.05),提示实验组自噬水平升高;RFP-GFP-LC3双荧光标记、LC3免疫荧光及透射电镜结果显示实验组自噬小体显著增多(P<0.05);MDC结果显示实验组酸性囊泡显著增多(P<0.05)。以上结果均提示下调鼻咽癌细胞cyclinB1的表达诱导自噬。4.转录组测序筛选自噬相关信号通路:转录组测序显示下调cyclinB1基因后一共有2721差异表达的基因,其中1653上调基因及1068下调基因。KEGG信号通路富集结果显示上调的基因主要富集在溶酶体及自噬相关信号通路上。Gene Ontology注释显示其功能主要涉及泛素化、蛋白结合、膜组装等。5.下调cyclinB1通过AMPK-ULK-1信号通路触发自噬:根据转录组测序的结果,应用Q-PCR及western blot进一步验证自噬相关信号通路。结果显示,下调cyclinB1的表达,可以显著提升AMPK激酶Thr172位点的磷酸化水平(P<0.05),而AMPK总蛋白表达未出现明显变化(P>0.05)。活化后的AMPK进一步磷酸化ULK-1 ser555和Beclin-1 ser93的位点(P<0.05),激活这些分子并促进自噬的过程。此外与自噬小体组装相关分子ATG4A表达水平也显著升高(P<0.05)。6.下调cyclinB1基因通过升高胞质和线粒体内ROS水平激活AMPK:应用流式细胞术检测下调cyclinB1基因后胞质ROS和线粒体mROS水平,化学发光法检测ATP水平,结果显示实验组胞质ROS和线粒体mROS水平均升高(P<0.05),而ATP水平则无明显变化(P>0.05)。7.ROS是下调cyclinB1基因诱导自噬的关键分子:应用ROS清除剂(NAC)抑制ROS水平,并下调cyclinB1的表达,结果显示ROS清除剂可抑制下调cyclinB1诱导的自噬,提示ROS是下调cyclinB1基因诱导自噬的关键分子。8.AMPK激酶是下调cyclinB1基因诱导自噬的关键分子:采用siRNA双下调cyclinB1和AMPK基因的表达,结果显示下调AMPK的表达可减少下调cyclinB1引起的自噬,提示AMPK激酶是下调cyclinB1基因诱导自噬的关键分子。9.CyclinB1在24种肿瘤中均存在异常升高:通过TCGA数据库调查cyclinB1在33种肿瘤中的表达。结果显示cyclin在24种肿瘤中均存在异常高表达,包括:肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌、结肠腺癌、淋巴肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、食管癌、多形性胶质母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞肝癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺癌、直肠腺癌、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、睾丸生殖细胞肿瘤、子宫体子宫内膜癌、子宫癌肉瘤。10.CyclinB1异常升高与不良预后密切相关:TCGA数据库调查cyclinB1的表达与患者预后的关系。结果显示以下肿瘤中cyclinB1异常升高与患者预后不良密切相关:肾上腺皮质癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肝细胞癌、脑低级别胶质瘤、肺腺癌、间皮瘤、胰腺腺癌、皮肤黑色素瘤。11.下调cyclinB1抑制鼻咽癌细胞的增殖:应用CCK-8和结晶紫实验检测下调cyclinB1后细胞增殖情况。结果显示,下调cyclinB1表达可以有效地抑制鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2的增殖。在下调48、72、96小时均展现出明显抑制效果(P<0.05)。12.下调cyclinB1促进鼻咽癌细胞的凋亡和衰老:应用Annexin V-FITC/PI及Tunel检测下调cyclinB1后细胞凋亡情况,β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老。结果显示,下调cyclinB1可促进鼻咽癌细胞CNE-1和CNE-2凋亡并诱导衰老(P<0.05)。13.下调cyclinB1联合自噬阻断剂可显著促进鼻咽癌凋亡和衰老,并抑制增殖。结论:1.下调cyclinB1的表达可触发鼻咽癌细胞自噬。2.下调cyclinB1通过ROS-AMPK-ULK-1依赖性信号通路调控自噬。3.下调cyclinB1可抑制鼻咽癌细胞的增殖。4.下调cyclinB1联合自噬阻断剂可以更有效地促进鼻咽癌细胞死亡,有望成为鼻咽癌治疗的新策略。