重组蛋白药物代表了一类具有天然结构和高度生理活性的新型药物。自1982年问世以来得到了迅猛的发展,短短20多年时间里已有约165个产品应用于临床,还有约270个正在研发,年销售额已达400亿欧元,并且造就了Amgen、Genentech、Biogen、Genzyme公司等这样的大型跨国医药企业。随着重组蛋白药物品种的增加及其应用的日益广泛,由于蛋白大分子口服吸收率低、体内半衰期短而采取的注射给药的方式已经越来越不能满足治疗的需要。比如,对于需要长期治疗的疾病,长达几年甚至一生的频繁注射,极大地影响了患者用药的顺应性;而对于只有一次注射机会的器官修复治疗,外源性重组细胞生长因子蛋白仅仅几个小时甚至几十分钟的体内半衰期远远不能维持长达几周的组织修复过程。通过输入基因在病变组织表达细胞因子的办法同样面临着基因的非病毒输送以及对于表达过程的调控等一系列难题。作为延长这类药物的体内作用时间的办法,缓释技术因其不改变蛋白分子的自然序列和化学结构,在药效、适应证和用药安全性上相对于其它长效方案具有明显的有时甚至是决定性的优势。然而,蛋白大分子的缓释面临着一些棘手的技术挑战,以致本领域科学家31年的研发努力至今未曾导致一个成功的上市产品。由于蛋白大分子具有多肽所不具备的脆弱易变的高级结构,在小分子化学药物和多肽药物上成功应用的缓释技术,因造成蛋白变性失活而不再适用。如何在缓释剂型的制备过程中保持蛋白大分子的自然形态和生物活性是实现蛋白大分子缓释的关键,也是本研究的目标。实现蛋白大分子缓释的一系列技术挑战包括:(1)蛋白在制剂过程和有机溶剂或者水-油界面张力接触而变性失活;(2)蛋白保护剂产生渗透压而引起释放初期的突释;(3)缓释期间蛋白发生聚集或在高分子上吸附而导致的不完全释放;(4)为保护蛋白而不得不采取的复杂和再现性很差的制备工艺;(5)制备蛋白缓释剂型的所有辅料必须能够安全地注射于人体。蛋白大分子缓释技术的成功有赖于对这些问题采取全面系统而不是顾此失彼的解决方案。对此,本研究采取了如下对策:(1)在温和条件下将结构脆弱的蛋白制备成对苛刻条件具有耐受性的多糖玻璃体微粒。本研究通过葡聚糖和聚乙二醇(PEG)水溶液的低温诱导相分离或低温水相-水相乳化,再通过进一步的冻干处理将结构脆弱的蛋白包封于葡聚糖微粒(直径在0.5μm -5μm间可调的)中,从而避免了通常的水-油乳化和喷雾干燥方法中的水-油界面和水-气界面对蛋白自然构象的破坏,同时使蛋白具有对有机溶剂和其他苛刻条件的高度耐受性。本研究还对文献中用锌离子沉淀蛋白的方法进行了改良,通过在PEG中的相分离使之从不规则的大颗粒变为粒径为0.2μm -0.5μm的细小的球形颗粒,从而提高了后续剂型制备的可操作性。(2)在对蛋白-多糖微粒进一步包封(即可降解缓释微球的制备)时避免多糖微粒的溶解以及水-油界面的出现。本研究将文献记载的“水包油、油包固体”(S/O/W)微球制备方法进行了改进,将作为使微球得以形成的水溶液连续相改为不溶多糖的配方称之为亲水“油相”(hydrophilic“oil phase”,下文中以hO标示),使S/O/W方法变为S/O/hO方法。这一方法避免了微球制备过程中蛋白-多糖微粒的溶解和溶出(从而提高了包封率),避免了水-油界面,当然也避免了溶解后的蛋白和水-油界面的接触这一造成蛋白变性失活的最主要原因。这一方法还避免了文献中所谓的“油包固体、油包油”(S/O/O)的方法中用有机溶剂清洗油相的过程。清洗过程中需用大量有机溶剂,造成安全和环境的隐患。(3)通过在缓释高分子基质中分散的多糖的性质(大分子量、亲水性、吸水后的黏度)使被环绕在其中的蛋白减少聚集和在高分子基质上的吸附从而降低不完全释放;通过对可降解高分子组成的调节,使微球形成“壳-核”结构,蛋白多糖颗粒被集中于核结构部分而降低了初期突释;改善了释放动力学。本研究利用模型蛋白(肌红蛋白、牛血清白蛋白、半乳糖苷酶)对上述微球制备技术进行了一系列考察。对这些蛋白-葡聚糖微粒的密度、XRD及DSC测试证明其为玻璃态。将半乳糖苷酶(β-Gal)这样一个具有四级结构的蛋白大分子作为模型包封于葡聚糖颗粒,在有机溶液中涡旋振荡、离心、回收酶的催化活性保持在90%以上,证明了多糖玻璃体包封蛋白对于蛋白的保护作用。本研究进一步通过光学及电子显微镜的观察确认了微球的圆整的形状、光滑的表面以及壳-核结构;通过模型蛋白(牛血清白蛋白BSA,肌红蛋白MGB)的缓释实验考察了微球制备工艺及其对蛋白缓释动力学的影响,优化了微球的组成和制备工艺,实现了80%以上的包封率和接近于零级的释放曲线;通过体积排阻色谱(SEC-HPLC)测试确认了包封在微球中的蛋白基本上不发生聚集。在方法优化成功的基础上,本研究尝试了将这一制剂技术用于蛋白药物重组人生长素的缓释微球制备,在初步实验中得到了理想的结果。制备微量的微球实现理想的包封率、不发生聚集和较好的体外释放曲线,及在大鼠体内的较平缓的血药浓度。蛋白-多糖微粒对有机溶剂的高度耐受性使之不仅可以用来制备可注射的缓释微球,还可用以制备具有药物治疗功能的治疗器械。本研究将载有蛋白(BSA、粒细胞集落刺激因子,即G-CSF)的多糖微粒混悬于可降解高分子溶液并涂层于心脏支架和止血纱布的表面。随即将涂层洗脱,回收蛋白,通过SEC-HPLC和细胞NFS-60作用对蛋白的聚集体和细胞增值活性进行了考察。蛋白样品保持了单体形态和80%的细胞NFS-60增殖活性(G-CSF)。蛋白可以从涂层的较缓慢的释放。针对蛋白大分子缓释技术中的一系列难题,逐一提出并且验证了新的解决方案,特别是对一系列单一问题的解决方案进行了系统性优化,避免了以往蛋白大分子缓释方法的研究中由于视角不同而产生的顾此失彼、因果互换的现象。通过在几个模型蛋白以及真正的蛋白药物(生长素)的实验,使多项技术指标(如包封率、聚集度、释放曲线)同时达到较满意的程度。可以说,本研究在蛋白大分子缓释微球的制备工艺上较全面地解决了至今为止阻碍蛋白大分子微球剂型成功的技术问题。另外,本研究中所提出并优化的方法不仅对于微球的制备,在其他用到可降解高分子和蛋白药物的治疗器械中也有广泛的应用。