恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病。随着分子生物学的发展,基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光。肿瘤的基因治疗,特别是肿瘤的自杀基因治疗,已经成为继传统的手术切除,放射治疗,化学治疗等治疗方法后一种崭新的肿瘤综合治疗措施。 自杀基因治疗由于存在旁杀伤效应的独特机制,已应用于多种肿瘤的临床治疗试验,并已观察到较好的效果。但仍有不少实验表明,单纯自杀基因治疗难以达到完全治愈肿瘤的目的。这是因为尽管应用自杀基因可消除大部分肿瘤负荷,但仍可有部分肿瘤细胞残余。因而提高自杀基因疗法的疗效以清除残余肿瘤细胞的研究成为了热点,联合治疗是其重要途径之一。由于免疫机制在自杀基因疗法旁杀伤效应中的重要作用,改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。自杀基因联合免疫基因成为目前最主要的联合治疗方案之一。该方案主要是在导入自杀基因的同时导入免疫基因。但该方案存在使用病毒载体量增多、潜在毒副作用增大;操作过程复杂,成本较高;导入基因间的相互干扰,影响基因表达或长期表达等问题。 临床与实验均已证明许多中药方药具有肯定的免疫药理作用;同时中药方药有多途径、多靶点的特点,可能对旁杀伤效应的其他机制也能产生影响。中药方药还有给药方便,价格低廉,长期使用毒副作用小或无明显毒副作用等优点。将自杀基因疗法与中药方药联合应用可能是一种更可行和更有效的联合治疗方案。 本研究选择了建立最早、研究最多的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,并构建成逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,将自杀基因疗法与最具肯定免疫药理作用的滋阴补肾代表复方六味地黄丸组成联合治疗方案,以小鼠移植性肝细胞癌和恶性黑色素瘤模型动物为治疗对象进行了初步的研究。通过研究以期探讨建立自杀基因联合中医药疗法的中西医结合肿瘤基因治疗方案的可行性。 1 材料与方法 1.1 HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 含自杀基因的pICl9R/MCl-tk质粒由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠,广州军区总医院赵亚刚博士提供。获得质粒后转入大肠杆菌DH5α,培养扩增,提取质粒,用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切、凝胶电泳鉴定,与原始质粒图比对确定质粒内含有tk基因;将tk基因定向克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,将重组pLXSN-tk质粒转入DH5α,培养扩增,提取质粒,双酶切、凝胶电泳及测序鉴定,确定重组质粒内含有tk基因;将重组逆转录病毒表达载体质粒转染病毒包装细胞PT67,用400mg/L G418筛选2周,获得抗性细胞集落(PT67/tk),在含G418的选择性培养液中扩大培养;取包装细胞PT67/tk培养上清液(内含已包装的病毒)加入NIH3T3细胞培