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目的：长期肠外营养会导致患者肝损害，但机制尚不明确。近来研究发现，双歧杆菌具有肝脏保护作用。本研究通过建立肠外营养(PN)幼兔肝损害动物模型，研究其肝损害特点和可能机制，并通过给PN幼兔添加双歧杆菌，探讨其是否具有肝脏保护作用。
材料与方法：生后2周的新西兰种白兔(体重200-250g)分为对照组、PN组和PN+双歧杆菌组。对照组幼兔母乳喂养，PN组幼兔每日经颈静脉插管连续24h输入营养液(210kca：l／kg／d)；PN+双歧组幼兔在输入和PN组等热量营养液同时，每日经胃管给予青春双歧杆菌活菌0.5x10<8>PN幼兔第9d口服乳果糖和甘露醇溶液2ml(含乳果糖100mg，甘露醇50mg)，收集24h尿液。PN第10d，自幼兔粪便中提取全部DNA，合成双歧杆菌和乳杆菌属特异性探针，应用SBYR GREEN I实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术对幼兔粪便进行双歧杆菌和乳杆菌定量测定。作回肠组织病理和电镜切片，观察显微和超微结构变化，并作回肠粘膜显微测量；采用偶氮基质显色鲎试验定量法测定血浆内毒素水平；作内脏组织(肠系膜淋巴结、脾、肺)匀浆和血培养观察细菌移位并计算细菌移位率；应用高效液相色谱(HPLC)技术检测幼兔尿中乳果糖和甘露醇含量，计算乳果糖、甘露醇排出率比值(L／M)。取幼兔静脉血测定血清ALT、AST、AKP、总胆红素、直接胆红素、胆汁酸等肝功能指标；作肝脏病理和电镜切片，观察显微和超微结构变化，并作肝脏病理分级评分。
结果：
1．幼兔粪便益生菌定量：使用双歧杆菌和乳杆菌属特异性引物作常规PCR，青春双歧杆菌扩增产物大小为1428bp，植物乳杆菌扩增产物大小约为600bp，阴性对照大肠杆菌未见电泳条带，说明此两种属特异性引物能准确地鉴别双歧杆菌和乳杆菌；通过对梯度稀释的青春双歧杆菌进行Real—time PCR灵敏度测定表明，10<2>个细菌仍有阳性曲线生长；扩增产物溶解曲线显示为单峰。PN组幼兔湿粪(0.05g)中双歧杆菌和乳杆菌含量(对数值)分别为4.62±0.24和4.29±0.49，显著低于对照组(分别为5.84±0.92，5.14±1.07，P<0.01)和双歧组(6.41±O.39，5.46±0.61，P<0.01)；双歧组两种细菌含量略高于对照组，但差异无显著统计学意义(P>0.05)。
2．肠屏障评价
①肠道形态学：末端回肠病理切片显示，PN组小肠绒毛明显萎缩，排列紊乱；双歧组小肠绒毛基本正常；显微测量结果显示，PN组小肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛面积显著低于对照组(P<0.05)，而双歧组和对照组比较，此3项指标差异均无显著意义(P>0.05)；超微照片显示，对照组回肠微绒毛致密，排列整齐，上皮细胞间连接紧密；PN组幼兔微绒毛明显稀疏，排列紊乱，上皮细胞间连接松散；双歧组幼兔回肠微绒毛较对照组稍疏松，排列尚整齐，上皮细胞问连接致密。
②肠道功能学：PN组幼兔肠系膜淋巴结、脾、肺、血细菌移
位率(77.5％)显著高于对照组(2.8％，P<0.0125)。双歧组细菌移位率(21.9％)和对照组比较，差异有显著意义(P=0.04)；和PN组比较，差异有非常显著意义(P<0.01)；PN组血浆内毒素为0.60±0.09Eu/ml，和对照组(0.09±0.03 Eu/m1)、双歧组(0.11±0.03 Eu/m1)比较，差异有非常显著意义(P<0.001)。HPLC结果显示对照组幼兔尿中乳果糖、甘露醇排出率比值(L/M)为0.019±0.005，PN组幼兔L/M升高至0.038±0.008，和对照组比较，有显著性差异(P<0.01)。双歧组LM为0.02±0.004，和对照组相当(P>0.05)，较PN组LM显著降低(P<0.01)。
3．肝功能评价
①肝脏生化指标：双歧组幼兔血清胆汁酸和总胆红素分别为(6.78±1.5)μm0l/L和(15.3±2.19)μm0l/L，和PN组(分别为17.3±1.3μm0l/L和26.6±3.6/μm0l/L)比较，差异有显著性(P<0.05)；和对照组(分别为5.9±0.8μm0l/L和12.6±2.7μm0l/L)比较，差异无显著性(P>0.05)。
②肝脏形态学：病理切片显示PN组幼兔肝细胞大量脂肪变，可见点状坏死、胆汁淤积和细胞凋亡。双歧组肝细胞轻度变性、纤维增生。参照L0ff肝脏病理学评分标准，PN组分值明显高于对照组和双歧组(P<0.05)，而双歧组和对照组比较，差异无显著意义(P>0.05)。肝脏超微结构显示，PN组幼兔肝细胞内含有较多的脂肪滴，线粒体肿胀，毛细胆管内微绒毛稀疏、排列紊乱，部分细胞内可见淤胆。双歧组幼兔肝细胞形态基本正常，无线粒体肿胀，肝细胞内含有少量脂肪滴，毛细胆管内微绒毛稍稀疏，排列尚整齐。
结论：
1．本研究应用先进的分子生物学细菌定量方法，即Real-timePCR法，采用细菌属特异性探针，对幼兔粪便中双歧杆菌和乳杆菌定量。结果显示，PN幼兔10天后粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量较对照组明显减少；添加外源性双歧杆菌后：PN幼兔粪便中双歧杆菌和乳杆菌数量显著增加。
2．应用精确的HPLC结合脉冲安培检测器，测定幼兔尿中乳果糖和甘露醇含量，评价肠道通透性。发现幼兔肠外营养10天肠道通透性较对照组显著增加；添加双歧杆菌可以降低PN幼兔肠道通透性，增强肠屏障功能。
3．幼兔肠外营养10天可出现肝细胞脂肪样变，肝内胆汁淤积，血清胆汁酸和总胆红素升高等肝损害表现；添加双歧杆菌可以减轻PN幼兔肝损害。
4．添加外源性双歧杆菌可能通过调节幼兔肠道益生菌，即增加双歧杆菌和乳杆菌数量，降低肠外营养幼兔肠道通透性，避免产生肠菌移位和内毒素血症，增强肠屏障功能，防止肠外营养导致的肝损害。