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目的：从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中克隆GRA6基因片段，构建重组质粒pGEX-GRA6，与本实验室已构建好的重组质粒pGEX-SAG1分别导入大肠杆菌中表达，且对表达产物进行纯化，以纯化的该两种重组蛋白作为诊断抗原，构建新型弓形虫基因工程诊断试剂盒，用于检测弓形虫感染及鉴别急、慢性期弓形虫病。方法：1．用CF-11纤维素柱快速提纯弓形虫速殖子，抽提弓形虫总DNA；根据基因库已报告的基因序列，设计并合成扩增GRA6基因的一对引物，采用聚合酶链反应(PCR)从昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增编码GRA6的基因片段，导入质粒pBluescriptIIS(-)，经DNA测序分析后，从构建好的重组质粒pSK-GRA6中以BamHI和EcoRI双酶切出GRA6基因片段，以相同的酶切位点导入表达质粒pGEX-5X-3，构建重组质粒pGEX-GRA6。将重组质粒pGEX-GRA6转化大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP菌株中，在IPTG诱导下表达，超声破壁后，SDS-PAGE分析表达产物的表达形式，对上清液中表达产物经硫酸铵沉淀、Sephadex G50脱盐和GST亲和层析柱进行目的蛋白的纯化。通过Western blotting检测其纯化重组抗原的免疫反应性。用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建立间接法ELISA检测弓形虫感染者血清特异性GRA6-IgM和GRA6-IgG的诊断方法；用获得的纯化GST-GRA6重组蛋白作为包被抗原，建立胶体金斑点渗滤法(DIGFA)检测弓形虫感染者血清特异性IgM弓形虫GRA6和SAG!幕l州克降表达及其产物的应用中文摘要和工gG的方法。2.将重组质粒pGEX一SAGI转化大肠杆菌BL21一CodonPlus(DE3)一RP菌株中，在IPTG诱导下表达;超声破壁后，sDs一队GE分析表达产物的表达形式。通过改变培养温度和LB培养液pH，诱导重组蛋白在上清液中表达，并对上清液中表达产物经硫酸按沉淀、SephadexG一50脱盐、GST亲和层析柱和sephadexG一1 50凝胶过滤柱进行目的蛋白纯化。通过Westem blotting检测其纯化重组蛋白的免疫反应性。用获得的纯化GST一SAGI重组蛋白作为包被抗原，建立间接ELIsA法检测人血清中弓形虫特异性IgM和IgG抗体的诊断方法。结果1.在我们所比较GRA6 336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致;得到一分子量为49kDa的重组蛋白，通过westem blotting证实该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM和IgG所识别。GRA6以融合蛋白(GST一GRA6)的形式在大肠杆菌中得到了高效表达。对表达产物亩溶性分析表明，表达蛋白在上清液中和包涵体中均有表达。在上清中表达的可溶性蛋白经纯化后蛋白纯度可达90%以上。用纯化的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒和DIGFA诊断试剂盒对弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。2.在常温条件下(37‘C)，SAGI以融合蛋白(GST一SAGI)的形式在大肠杆菌中得到了高效表达，对表达产物可溶性分析表明，表达蛋白以包涵体形式存在。在低温和升高LB培养液pH条件下，在上清液中得到了可溶性重组蛋白，经纯化后蛋白纯度可达90%以上。Westem弓形虫川之八6和S八(月呆}川克降表达及比产物的应用甲丈、芍吐b!otting分析表明一该纯化蛋白能被弓形虫感染者一血一清所识别。川纯化的SAG!重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒对弓形虫感染者血一清进行sAGI一lgM一ELISA检测，结果显示:该诊断试剂盒只对部分弓形虫多克隆IgM抗体血清呈阳性结果，选用其中一份阳性和一份阴性血清进行免疫印迹试验，其结果与我们用SAGI一IgM一ELISA检测结果相同，表明我们研制的检测SAGI一工gM一ELISA诊断试剂盒司一用于急、慢性期弓形虫感染的鉴别。结论1.①弓形虫昆!_助分离株和RH株GRA6基因片段少匕乎完全一致;②在大肠杆菌中得到了高效表达的可溶性重组蛋白GST一GRA6;③该重组蛋白能被弓形虫感染者血清特异性IgM和工gG所识别，可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫感染检测试剂盒。用纯化的GRA6重组蛋白构建的ELISA诊断试剂盒和DIGFA诊断试剂盒对弓形虫感染者血清进行检测，其结果一致。2.①在大肠杆菌中表达了GST一SAGI重组蛋白;②通过改变培养温度和LB培养液pH，首次成功地在上清液中得到了可溶性SAGI重组蛋白;③该可溶性重组蛋白能被急性期弓形虫感染者血清IgM所识别，可用于构建弓形虫检测试剂盒，鉴别急、慢性期弓形虫感染。