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本研究探讨中药川芎茶调散及其有效成分川芎嗪和EGCG对MPTP所致小鼠DA神经元损伤的保护作用及机制,主要分三部分:1.不同造模方法MPTP所致PD小鼠模型的比较;2.川芎茶调散对MPTP所致DA神经元损伤的保护及机制的研究.3.川芎茶调散主要有效成分川芎嗪、EGCG对MPTP所致DA神经元损伤的保护及机制的研究.
方法：1.实验动物:C57BL/6J雄性小鼠,1-2月龄,体重(18-22g);3-5月龄,体重(26-30g).
2.检测指标:①爬杆实验检测PD小鼠运动行为;
②HPLC法检测小鼠大脑纹状体DA含量;
③免疫组化法检测小鼠大脑黑质DA神经元损伤情况;
④荧光比色法检测小鼠大脑黑质SOD活力及GSH含量;
⑤荧光比色法检测川芎茶调散对体外自由基(DPPH·)的清除能力3.分组:本研究共分三部分实验,动物分组如下:(1)不同造模方法MPTP所致PD模型的比较:①不同年龄小鼠MPTP所致PD模型的比较:将1-2月龄小鼠(低龄组)和3-5月龄小鼠(高龄组)各自随机分为对照组和模型组,共四组动物:低龄对照组(n=7)、低龄模型组(n=8);高龄对照组(n=7)、高龄模型组(n=8);
②MPTP不同给药方法所致小鼠PD模型的比较:根据不同的MPTP给药方式将3-5月龄小鼠随机分为三组:生理盐水对照组(n=8)、模型A组(MPTP 15 mg/kg x4,4次,间隔2小时,n=7)、模型B组(MPTP 40 mg/kg xl,单次,n=9).(2)川芎茶调散对MPTP所致DA神经元损伤的保护及机制:将3-5月龄小鼠随机分为6组:生理盐水对照组(NS+NS)、川芎茶调散(中药)对照组(5CXCq、+NS)、2.5倍剂量中药模型组(2.5CXCT+MPTP)、5倍剂量中药模型组(5CXCT+MPTP)、7.5倍剂量中药模型组(7.5CXCT+MPTP)、生理盐水模型组(NS+MPTP),每组8只动物.(3)川芎茶调散主要有效成分EGCG、川芎嗪对MPTP所致DA神经元损伤的保护及机制:将3-5月龄小鼠随机分为6组:牛理盐水对照组(NS+NS)、生理盐水模型组(NS+MPTP)、EGCG高剂量模型组(EGcG50+MPTP)、EGCG低剂量模型组(EGCG20+MPTP)、川芎嗪高剂量模型组(LT50+MPTP)、川芎嗪低剂量模型组(LT20+MPTP)每组8只动物.
结果：1.不同造模方法MPTP所致PD模型的比较
(1)不同年龄小鼠MPTP所致PD模型的比较:低龄和高龄对照组小鼠纹状体内DA含量基本为同一水平,且低龄和高龄模型组纹状体内的DA均较各自对照组明显降低(D<0.01).而高龄模型组较低龄模型组DA含量降低程度更大,两组比较有显著性差异(p<0.05).(2)MPTP不同给药方式所致小鼠PD模型的比较:模型A组和模型B组小鼠纹状体内DA含量均较生理盐水对照组明显降低(p<0.01),而模型A组较模型B组DA降低程度更大,两组比较有显著性差异(p<0.05).
以上结果提示不同年龄的C57BL/6J小鼠对MPTP都有较强的敏感性,高龄组小鼠较低龄组小鼠对MPTP更为敏感;两种MPTP造模方式均能有效诱导PD模型,模型A组较模型B组致损伤程度更大.
2.川芎茶调散对MPTP所致DA神经元损伤的保护及机制
(1)在MPTP处理0.5小时后,行为学结果显示:给予不同剂量的川芎茶调散(CXCT)保护对PD动物的运动协调型均有一定的改善作用(p<0.01);(2)在MPTP处理7天后,HPLC结果显示:7.5CXCT+MPTP组纹状体DA含量明显高于NS+MPTP组(p<0.05);(3)在MPTP处理7天后,免疫组化法检测结果显示:7.5CXCT+MPTP组黑质DA神经元数量明显高于NS+MPTP组(p<0.05);(4)在MPTP处理7天后,荧光比色法结果显示:5CXCT+MPTP组和7.5CXCT+MPTP组黑质SOD活力明显高于NS+MPTP组(p<0.05);(5)体外自由基清除实验显示:川芎茶调散对体外自由基(DPPH.)有较强的清除能力.
以上结果提示7.5倍川芎茶调散能有效保护MPTP引起的DA神经元的损伤,保护机制与川芎茶调散调节小鼠黑质中的SOD活力及自由基清除能力有关.
3.川芎茶调散主要有效成分EGCG和川芎嗪对MPTP致DA神经元损伤的保护及机制
(1)纹状体DA含量检测结果显示:EGCG50+MPTP、EGCG20+MPTP、LT50+MPTP组纹状体DA含量较NS+MPTP组显著增高(p<0.01);(2)黑质DA神经元检测结果显示:EGCG50+MPTP组和LT50+MPTP组黑质DA神经元数量明显高于NS+MPTlP组(p<0.05);(3)黑质SOD活力检测结果显示:EGCG50+MPTP组和LT50+MPTP组相对于NS+MPTP组黑质SOD活力显著增高(p<0.01);(4)黑质GSH含量检测结果显示:EGCG50+MPTP、EGCG20+MPTP、LT50+MPTP、LT20+MPTP各组黑质GSH含量均较NS+MPTP组明显增高(p<0.01).
以上结果提示高剂量的EGCG和川芎嗪能有效保护MPTP引起的DA神经元的损伤,保护机制与其调节调节小鼠黑质中的SOD、GSH含量有关.
结论：1.不同年龄的C57/BL小鼠对MPTP敏感性不同,3-5月龄的较1-2月龄的小鼠更为敏感,适合作为PD动物模型用于研究;两种不同MPTP造模方式均能有效诱导PD-模型A组(15 mg/kg x4)、模型B组(40mg/kg x1).多次低剂量造模法较单次高剂量造模法致DA神经损伤程度更大,且不可逆.两种造模方法可应用于不同目的的实验研究.
2.川芎茶调散可改善MPTP所致的小鼠PD模型的运动障碍,同时能对MPTP引起的纹状体DA耗竭和黑质DA神经元损伤起到保护作用,这种保护作用在一定范围内呈剂量相关性,高剂量较低剂量有效.同时川芎茶调散增高黑质中SOD活力,且对体外自由基清除能力较强,因此,川芎茶调散对DA神经元的保护作用可能其与较强的抗氧化能力有关.
3.川芎茶调散的有效成分EGCG、川芎嗪同样具有较强的保护MPTP引起的DA神经元损伤的作用,且保护作用在一定范围内呈剂量相关性,高剂量较低剂量有效.抗氧化作用是川芎嗪和EGCG对DA神经元保护作用的机制之一.
4.实验结果证实了川芎茶调散及其有效活性成分EGCG、川芎嗪都具有神经保护作用,能对抗MPTP诱导的DA神经元损伤,提示川芎茶调散可能对PD病人的神经退行性变起到保护作用.鉴于两种有效活性成分都具有显著性的神经保护作用,我们可以寻找其最佳剂量和药物配伍来作为治疗PD的新型有效药物.川芎茶调散的神经保护作用可能与其较强的抗氧化作用有关,从而进一步证实了氧化应激在PD发病机制中的重要作用.