二氢槲皮素及其衍生物制备、活性及抗衰老机制研究

来源 :北京林业大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:ernest5
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本论文以兴安落叶松木桩为原料,采用闪式提取法制备二氢槲皮素(DHQ),并利用胺甲基化法制备二氢槲皮素衍生物(DHQA),重点开展了 DHQ和DHQA的提取与制备、结构鉴定、活性测定、药代动力学、酶动力学及抗衰老分子机制研究。主要研究结果如下:1.通过单因素实验和响应面法对闪式提取兴安落叶松DHQ工艺条件进行优化。结果表明:各因素对DHQ提取得率的影响依次为:乙醇浓度>料液比>闪提时间>浸提时间。最佳工艺条件为:闪提时间3min、浸提时间3h、料液比1:15、乙醇浓度75%。在此条件下,DHQ提取得率为6.15%,与模型预测值相对误差为0.99%。2.利用HPLC、扫描电镜、红外光谱和XRD衍射,对闪式提取法制备的DHQ样品进行定性、定量以及结构分析,结果表明:DHQ样品的纯度为96%,且表观结构、官能团伸缩振动以及衍射吸收峰均与标准品的特征几乎一致。3.利用胺甲基双基取代法制备DHQA,克服了 DHQ水溶性差和生物利用度低的缺点。通过HPLC、核磁共振、扫描电镜、XRD衍射和热重对DHQA结构和物理性质进行研究,结果表明:DHQA是一种具有二氢槲皮素母核结构的球形、松散和多孔状态的非晶体物质。通过溶解性和体外溶出度实验,得出DHQA的水溶性和溶出度分别比DHQ提高了 16.28和6.31倍。利用MTT法测定DHQA细胞毒性,结果表明:DHQA对正常HEK-293T细胞生长没有抑制作用(ECso=820.00 μM),对Hela细胞具有较好的抑制效果(ECso=138.17μM)。通过体外抗氧化实验,得出DHQA具有非常强的抗氧化能力,对DPPH自由基清除能力和总还原力能力比抗坏血酸(Vc)能力强,对ABTS自由基清除能力与Vc几乎一致。同时,DHQA对ABTS自由基清除能力和总还原力能力比DHQ的能力强。通过药代动力学研究得出DHQA在30min达到最大浓度22.03μg/mL,约为DHQ的2.5倍。4.通过果蝇生存实验、生化指标和相关酶合成基因表达量测定,研究DHQ和DHQA对正常组果蝇抗衰老机制。结果表明:各剂量组均能延长雌、雄果蝇的寿命,提高体内抗氧化酶活性,减少MDA的含量。对于雌蝇,0.5mM DHQ剂量组和0.25mM DHQA剂量组为雌果蝇寿命延长最佳剂量组,显著性提高雌蝇T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD和CAT活力以及降低MDA含量(P<0.05),仅在提高CuZn-SOD和Mn-SOD活力以及降低MDA含量上,组间有显著性差异(P<0.05),在CuZn-SOD和Mn-SOD相对基因表达量上,组间差异显著(P<0.05);对于雄蝇,1mM DHQ剂量组和0.5mM DHQA剂量为雄蝇寿命延长最佳剂量组,显著性提高雄蝇以上4种酶活力及降低MDA含量(P<0.05),仅在提高Mn-SOD和CAT活力以及降低MDA含量上,组间有显著性差异(P<0.05),在Mn-SOD和CAT相对基因表达量上,组间差异显著(P<0.05);对于比雌蝇和雄蝇最佳剂量组高的剂量组,在与最佳剂量组相比时,均显著性降低对果蝇寿命的延长、酶含量及增加MDA含量(P<0.05),这说明过多食用DHQ和DHQA可能会对机体造成一定的毒副作用。5.通过果蝇生存实验、生化指标和相关酶合成基因表达量测定,研究DHQ和DHQA对高脂组果蝇寿命及体内抗氧化酶的影响。结果表明:各剂量组均显著性拮抗高脂对雌蝇和雄蝇造成的伤害(P<0.05),1mM DHQ剂量组和0.5mM DHQA剂量组为雌、雄蝇最佳剂量组,与模型对照组相比,均显著性提高以上4种酶活力以及降低MDA含量(P<0.05),但是各剂量组雌雄蝇体内SOD增加量并不大,只有CAT和MDA含量变化较大,尤其是MDA含量,与3种酶的相对基因表达量趋势一致,说明DHQ和DHQA可能是通过提高过氧化氢酶活力以及抵抗细胞膜脂质过氧化,减少高脂对果蝇造成的氧化损伤,具体作用机理需要进一步深入研究。6.通过H202和百草枯实验研究DHQ和DHQA对果蝇氧化损伤的保护作用。结果表明:各剂量组均能有效减少上述试剂对雌、雄果蝇的氧化性损伤,最佳剂量组与正常组寿命实验结果一致,均显著性提高果蝇寿命(P<0.05),且组间差异均显著(P<0.05)。由寿命指标发现,雌、雄果蝇抵御百草枯氧化损伤能力要比H2O2强,说明DHQ和DHQA能更好的保护超氧阴离子自由基对机体的损伤。7.DHQ和DHQA酶动力学及与Vc协同抗氧化研究,主要结果:①对酪氨酸酶活性具有一定的抑制能力,尤其高浓度DHQA对酪氨酸酶抑制能力与β-熊果苷几乎一致。②对乙醇脱氢酶(ADH)与乙醛脱氢酶(ALDH)均具有非常强的激活作用,在4mM时,两者对ADH的激活率分别为71.83%和68.09%;在1mM时,两者对ALDH的激活能力达到100%。③与Vc具有一定的协同抗氧化能力,对于清除不同的自由基,所需Vc含量不同。
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