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研究目的：
肝细胞癌（(Hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球第五大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。肝癌转移是其高复发率和不良预后的主要原因，手术切除和肝移植是目前临床上治疗肝癌的最佳选择，但治疗效果不佳。因此，揭示肝癌转移的发病机制具有重要的医学意义。
Sirtuins（SIRTs）是第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在调节酵母、蠕虫和苍蝇的寿命方面发挥重要作用。其中，Sirtuin5（SIRT5）因其独特的蛋白翻译后修饰（post-translationalmodification，PTM）活性和生化生理功能成为研究热点。SIRT5通过去乙酰化并激活氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoylphosphatesynthetase1，CPS1）调节尿素循环。SIRT5还可以去乙酰化FOXO3，减少肺上皮细胞的凋亡。研究发现SIRT5在多种癌症中表达异常、功能各异，SIRT5在肿瘤进展中所发挥的作用得到越来越多的关注，但其在HCC中的作用仍不清楚。
中间纤维是真核细胞细胞骨架的主要组成部分。Vimentin为Ⅲ型中间纤维蛋白(Intermediatefilament，IF)，是IF蛋白家族中最为保守和丰富的蛋白之一。Vimentin在肿瘤细胞中的表达被认为是上皮间充质转化(epithelialalmesenchymaltransition,EMT)的标志之一，与细胞侵袭和预后不良有关。Vimentin有各种功能重要的蛋白翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、类泛素化和ADP核糖基化等翻译后修饰来执行其功能。然而，vimentin的其他修饰（如乙酰化）是否参与肝癌EMT过程尚不清楚。我们猜想SIRT5是否通过其去乙酰化酶学活性作用于Vimentin，在肝癌的转移过程发挥一定作用？因此，本研究旨在探讨SIRT5和vimentin乙酰化在肝癌中的作用。
实验方法：
1.从TCGA数据库的肝细胞癌数据集下载了424例HCC患者的RNAseq数据。分析并比较了SIRT5在374例肝癌和50例癌旁中的mRNA表达水平。
2.我们收集了19例肝癌患者的组织样本，采用Westernblot实验检测了SIRT5在肝癌和癌旁组织中的蛋白的表达。
3.为了研究SIRT5的细胞生物学功能，采用transwell和划痕实验，观察SIRT5对细胞迁移能力的影响。
4.构建SIRT5-shRNA慢病毒表达载体，感染SNU449细胞，用嘌呤霉素筛选稳定感染了SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的细胞，提取细胞总蛋白，Westernblot检测SIRT5的敲降效果。
5.将稳定转染SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的SNU449细胞接种于裸鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。观察肿瘤生长情况、绘制肿瘤生长曲线，取下瘤体石蜡包埋、切片后HE染色。
6.通过尾静脉注射法建立裸鼠模型，两组裸鼠分别注射稳定转染SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的SNU449肝癌细胞。
7.苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining，HE染色）用于制作裸鼠肝、肺组织病理切片染色，明确各组裸鼠的肝、肺转移的病理诊断，并进行区分对比各组肝、肺转移的情况。
8.利用Westernblot法检测HCC细胞敲减SIRT5后相关EMT蛋白标志物的表达。
9.利用Co-IP的方法验证SIRT5与Vimentin的相互作用。
10.利用液相色谱-质谱（LC/MC）方法鉴定Vimentin乙酰化修饰位点。
11.从TCGA数据库的肝细胞癌数据集下载了424例HCC患者的RNAseq数据。比较vimentin在374例肝癌和50例癌旁中的mRNA表达水平，并分析SIRT5与vimentinmRNA水平的相关性。
12.按照MutExpressIIFastMutagenesiskitV2点突变试剂盒方法将质粒Vimentin（WT）突变成Vimemtin（K120R）、Vimemtin（K120Q），质粒SIRT5（WT）突变为SIRT5（H158Y），测序确认突变成功。细胞转染相应的质粒后，通过transwell实验验证SIRT5降低导致Vimentin的乙酰化对细胞迁移的影响。
结果：
1.TCGA数据库RNAseq分析结果显示，SIRT5在肝癌组织的mRNA水平显著下调（*P<0.05），SIRT5低表达患者预后差（**P<0.01）。
2.临床样本结果显示，与癌旁相比，SIRT5的蛋白表达在肝癌组织中显著降低（*P<0.05）。
3.Transwell和划痕实验证明，与对照相比，下调SIRT5，SNU449和HepG2细胞的迁移能力显著加强（*P<0.05）；反之，与对照相比，过表达SIRT5，7402细胞迁移能力显著下降（*P<0.05）。
4.经病毒感染条件摸索，慢病毒在MOI值为120且用ENi.S.替代常规培养基时病毒对SNU449细胞的感染效率达80%以上，且细胞状态良好，确定为病毒的最佳感染条件。经Westernblot实验验证，与Scramble-shRNA对照组相比，SIRT5-shRNA慢病毒组SNU449细胞中SIRT5蛋白表达明显下调。
5.裸鼠皮下成瘤实验证明，实验组（SNU449稳转SIRT5-shRNA慢病毒）小鼠皮下成瘤大小与对照组（Scramble-shRNA）相比无明显差异，差别无统计学意义（P>0.05）。
6．在裸鼠转移模型，HE染色发现，与对照组相比，实验组小鼠肝组织中的转移灶面积增大，转移灶数量显著增多，差别有统计学意义（*P<0.05）。小鼠肺部未见转移灶。
7.SIRT5的下调促进了EMT相关蛋白的表达，表现为EMT相关转录因子Snail表达上升（*P<0.05）、EMT上皮标志物E-cadherin表达下降（*P<0.05）；而过表达SIRT5，Snail表达下降（*P<0.05）、E-cadherin表达升高（*P<0.05）。
8.Co-IP实验证明SIRT5与Vimentin相互结合。
9.通过LC/MC鉴定，与对照相比，下调SIRT5后，Vimentin的第120位赖氨酸发生乙酰化修饰。
10.TCGA数据库RNAseq分析结果显示，Vimentin在肝癌组织的mRNA水平显著升高（*P<0.05），SIRT5与Vimentin在mRNA表达水平显著负相关（r=-0.319，**P=0.000）。
11.Transwell实验证明，下调SIRT5并过表达vimentin（WT）和vimentin（K120Q）均促进细胞迁移，而Vimentin（K120R）则抑制SNU449细胞迁移。过表达SIRT5（WT）能够逆转过表达Vimentin（WT）对BEL-7402细胞促迁移作用，但SIRT5（H158Y）却不能逆转；同样地，过表达SIRT5（WT）不能逆转Vimentin（K120R）对细胞迁移的影响。
结论：
综上所述，与癌旁相比，SIRT5在肝细胞癌组织中低表达。SIRT5下调导致的Vimentin第120位赖氨酸乙酰化在促进肝癌迁移的过程中起着关键作用。
肝细胞癌（(Hepatocellularcarcinoma，HCC）是全球第五大常见癌症，也是导致癌症相关死亡的第二大原因。肝癌转移是其高复发率和不良预后的主要原因，手术切除和肝移植是目前临床上治疗肝癌的最佳选择，但治疗效果不佳。因此，揭示肝癌转移的发病机制具有重要的医学意义。
Sirtuins（SIRTs）是第Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，在调节酵母、蠕虫和苍蝇的寿命方面发挥重要作用。其中，Sirtuin5（SIRT5）因其独特的蛋白翻译后修饰（post-translationalmodification，PTM）活性和生化生理功能成为研究热点。SIRT5通过去乙酰化并激活氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoylphosphatesynthetase1，CPS1）调节尿素循环。SIRT5还可以去乙酰化FOXO3，减少肺上皮细胞的凋亡。研究发现SIRT5在多种癌症中表达异常、功能各异，SIRT5在肿瘤进展中所发挥的作用得到越来越多的关注，但其在HCC中的作用仍不清楚。
中间纤维是真核细胞细胞骨架的主要组成部分。Vimentin为Ⅲ型中间纤维蛋白(Intermediatefilament，IF)，是IF蛋白家族中最为保守和丰富的蛋白之一。Vimentin在肿瘤细胞中的表达被认为是上皮间充质转化(epithelialalmesenchymaltransition,EMT)的标志之一，与细胞侵袭和预后不良有关。Vimentin有各种功能重要的蛋白翻译后修饰，如磷酸化、糖基化、类泛素化和ADP核糖基化等翻译后修饰来执行其功能。然而，vimentin的其他修饰（如乙酰化）是否参与肝癌EMT过程尚不清楚。我们猜想SIRT5是否通过其去乙酰化酶学活性作用于Vimentin，在肝癌的转移过程发挥一定作用？因此，本研究旨在探讨SIRT5和vimentin乙酰化在肝癌中的作用。
实验方法：
1.从TCGA数据库的肝细胞癌数据集下载了424例HCC患者的RNAseq数据。分析并比较了SIRT5在374例肝癌和50例癌旁中的mRNA表达水平。
2.我们收集了19例肝癌患者的组织样本，采用Westernblot实验检测了SIRT5在肝癌和癌旁组织中的蛋白的表达。
3.为了研究SIRT5的细胞生物学功能，采用transwell和划痕实验，观察SIRT5对细胞迁移能力的影响。
4.构建SIRT5-shRNA慢病毒表达载体，感染SNU449细胞，用嘌呤霉素筛选稳定感染了SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的细胞，提取细胞总蛋白，Westernblot检测SIRT5的敲降效果。
5.将稳定转染SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的SNU449细胞接种于裸鼠皮下，建立皮下移植瘤模型。观察肿瘤生长情况、绘制肿瘤生长曲线，取下瘤体石蜡包埋、切片后HE染色。
6.通过尾静脉注射法建立裸鼠模型，两组裸鼠分别注射稳定转染SIRT5-shRNA和Scramble-shRNA的SNU449肝癌细胞。
7.苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosinstaining，HE染色）用于制作裸鼠肝、肺组织病理切片染色，明确各组裸鼠的肝、肺转移的病理诊断，并进行区分对比各组肝、肺转移的情况。
8.利用Westernblot法检测HCC细胞敲减SIRT5后相关EMT蛋白标志物的表达。
9.利用Co-IP的方法验证SIRT5与Vimentin的相互作用。
10.利用液相色谱-质谱（LC/MC）方法鉴定Vimentin乙酰化修饰位点。
11.从TCGA数据库的肝细胞癌数据集下载了424例HCC患者的RNAseq数据。比较vimentin在374例肝癌和50例癌旁中的mRNA表达水平，并分析SIRT5与vimentinmRNA水平的相关性。
12.按照MutExpressIIFastMutagenesiskitV2点突变试剂盒方法将质粒Vimentin（WT）突变成Vimemtin（K120R）、Vimemtin（K120Q），质粒SIRT5（WT）突变为SIRT5（H158Y），测序确认突变成功。细胞转染相应的质粒后，通过transwell实验验证SIRT5降低导致Vimentin的乙酰化对细胞迁移的影响。
结果：
1.TCGA数据库RNAseq分析结果显示，SIRT5在肝癌组织的mRNA水平显著下调（*P<0.05），SIRT5低表达患者预后差（**P<0.01）。
2.临床样本结果显示，与癌旁相比，SIRT5的蛋白表达在肝癌组织中显著降低（*P<0.05）。
3.Transwell和划痕实验证明，与对照相比，下调SIRT5，SNU449和HepG2细胞的迁移能力显著加强（*P<0.05）；反之，与对照相比，过表达SIRT5，7402细胞迁移能力显著下降（*P<0.05）。
4.经病毒感染条件摸索，慢病毒在MOI值为120且用ENi.S.替代常规培养基时病毒对SNU449细胞的感染效率达80%以上，且细胞状态良好，确定为病毒的最佳感染条件。经Westernblot实验验证，与Scramble-shRNA对照组相比，SIRT5-shRNA慢病毒组SNU449细胞中SIRT5蛋白表达明显下调。
5.裸鼠皮下成瘤实验证明，实验组（SNU449稳转SIRT5-shRNA慢病毒）小鼠皮下成瘤大小与对照组（Scramble-shRNA）相比无明显差异，差别无统计学意义（P>0.05）。
6．在裸鼠转移模型，HE染色发现，与对照组相比，实验组小鼠肝组织中的转移灶面积增大，转移灶数量显著增多，差别有统计学意义（*P<0.05）。小鼠肺部未见转移灶。
7.SIRT5的下调促进了EMT相关蛋白的表达，表现为EMT相关转录因子Snail表达上升（*P<0.05）、EMT上皮标志物E-cadherin表达下降（*P<0.05）；而过表达SIRT5，Snail表达下降（*P<0.05）、E-cadherin表达升高（*P<0.05）。
8.Co-IP实验证明SIRT5与Vimentin相互结合。
9.通过LC/MC鉴定，与对照相比，下调SIRT5后，Vimentin的第120位赖氨酸发生乙酰化修饰。
10.TCGA数据库RNAseq分析结果显示，Vimentin在肝癌组织的mRNA水平显著升高（*P<0.05），SIRT5与Vimentin在mRNA表达水平显著负相关（r=-0.319，**P=0.000）。
11.Transwell实验证明，下调SIRT5并过表达vimentin（WT）和vimentin（K120Q）均促进细胞迁移，而Vimentin（K120R）则抑制SNU449细胞迁移。过表达SIRT5（WT）能够逆转过表达Vimentin（WT）对BEL-7402细胞促迁移作用，但SIRT5（H158Y）却不能逆转；同样地，过表达SIRT5（WT）不能逆转Vimentin（K120R）对细胞迁移的影响。
结论：
综上所述，与癌旁相比，SIRT5在肝细胞癌组织中低表达。SIRT5下调导致的Vimentin第120位赖氨酸乙酰化在促进肝癌迁移的过程中起着关键作用。