目的:大量流行病学研究发现,牙周炎是阿尔兹海默症（Alzheimer’s disease,AD）的危险因素之一。牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis）作为重要的牙周致病菌,其在AD疾病进程中的作用及相关机制是目前的研究热点。P.gingivalis重要毒力因子牙龈蛋白酶在大脑海马体神经元内沉积,与AD疾病进程密切相关。研究发现,牙周炎影响系统性疾病的主要致病机制是龈下菌斑生物膜细菌直接进入牙周组织血管中引发菌血症。血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是脑组织内重要的结构和功能性屏障,具有较低的转胞吞作用及较强的紧密连接结构,能够选择性调节大分子物质进出,从而有效阻止病原微生物、毒性物质进入中枢神经系统（central nervous system,CNS）,并且其功能紊乱是AD的早期标志之一。脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）是研究BBB损伤机制的重要细胞。研究发现细菌微生物在特定情况下可引起BBB功能损伤,并且可以突破BBB进入中枢神经系统,是引发AD的重要环节和因素。增强转胞吞作用及破坏紧密连接结构是细菌破坏BBB的主要方式。学者研究发现,不同细菌在破坏BBB通透性中机制不同。例如大肠杆菌、B族链球菌、肺炎链球菌、李斯特菌等通过跨细胞转运途径进而突破BBB,而脑膜炎奈瑟菌等可通过细胞旁途径进而进入脑内。胞膜窖是细胞膜内陷形成的特异性的凹陷结构,大约为50-100 nm。小窝蛋白-1（Caveolin-1,Cav-1）是胞膜窖最主要的结构蛋白,其在脑微血管内皮细胞中高表达。主要促进因子超家族成员（Major facilitator superfamily domain containing 2a,Mfsd2a）是MFS家族中重要的调控分子,在维持BBB功能、抑制BMECs转胞吞及调控胞膜窖形成中发挥重要作用。目前,P.gingivalis对BBB的具体作用报告较少,机制尚不明确,并且Mfsd2a及Cav-1在P.gingivalis对BBB通透性的调控机制仍未见相关报告。基于以上的研究背景,本实验通过SD大鼠尾静脉注射P.gingivalis及建立体外Transwell BBB模型,观察P.gingivalis对BBB通透性影响及AD相关行为学及病理改变,进一步探究P.gingivalis是否通过调控转胞吞作用及可能分子机制。本研究期望通过揭示P.gingivalis对BBB生物学功能的影响及其调控机制,初步分析P.gingivalis或其毒力因子进入脑内的转运途径,从抑制P.gingivalis感染角度为AD的预防及治疗提供新的策略。研究方法:1.尾静脉注射P.gingivalis对AD相关行为及病理改变的影响 SD大鼠尾静脉注射P.gingivalis菌液,其中低剂量组注射200μL菌液含1.0×10~3CFU个P.gingivalis细菌,高剂量组注射200μL菌液含1.0×10~8CFU个P.gingivalis细菌,对照组注射200μL PBS,注射时间为8周。水迷宫、新物体识别实验检测P.gingivalis对大鼠AD相关学习记忆能力的影响。苏木精-伊红染色观察静脉注射P.gingivalis引起大鼠海马体及大脑皮层组织病理学改变。免疫组织化学染色检测海马体中β淀粉样蛋白1-42（amyloid-βpeptide1-42,Aβ1-42）。2.尾静脉注射P.gingivalis对BBB通透性的影响 伊文斯兰观察P.gingivalis对BBB通透性改变的影响,Western blot检测P.gingivalis对SD大鼠海马体及大脑皮层中白蛋白、纤维蛋白原蛋白水平的影响。构建体外Transwell BBB模型,在Transwell上室中放入不同MOI值P.gingivalis（10,100,500）处理24 h,琼脂培养法检测下室菌体通过情况;流式细胞术检测P.gingivalis对脑微血管内皮细胞系（b End.3）细胞通透性的影响。3.P.gingivalis对脑微血管内皮细胞转胞吞途径及其关键分子Cav-1表达的作用研究mRNA转录组学高通量测序技术分析P.gingivalis感染b End.3后差异基因表达及其富集通路分析。透射电子显微镜观察P.gingivalis感染后SD大鼠海马体及大脑皮层脑微血管内皮细胞超微结构改变。透射电子显微镜观察P.gingivalis进入b End.3的情况。Western blot检测P.gingivalis感染后SD大鼠海马体及大脑皮层紧密连接相关闭锁蛋白（Occludin,OCLD）表达情况。免疫组织化学染色检测转胞吞作用关键蛋白Cav-1的表达水平。采用si RNA干扰技术抑制Cav-1表达,之后加入P.gingivalis刺激,q RT-PCR检测P.gingivalis内化数量,流式细胞术检测细胞通透性的影响。激光共聚焦显微镜观察P.gingivalis感染b End.3后细胞膜表面Cav-1表达及其与P.gingivalis共定位情况。质谱分析筛选与Cav-1存在互作的P.gingivalis毒力因子,并进一步通过数据库对筛选分子进行分析。计算机分子模拟Cav-1与精氨酸牙龈蛋白酶A（arginine-gingipains A,Rgp A）蛋白三维结构对接情况。4.Mfsd2a在调控P.gingivalis增强脑微血管内皮细胞通透性中的机制研究 聚类分析筛选调控BBB通透性及上调Cav-1水平的关键分子,应用Western blot对筛选出的差异表达蛋白Mfsd2a进行验证。免疫荧光染色观察P.gingivalis感染SD大鼠脑组织中Mfsd2a定位情况。分别采用si RNA干扰技术抑制Mfsd2a表达、转染过表达质粒上调Mfsd2a表达,细胞转染后加入P.gingivalis继续感染,q RT-PCR检测P.gingivalis内化数量,流式细胞术检测细胞通透性的影响。过表达Mfsd2a后,Western blot检测其对Cav-1蛋白表达的影响。结果:1.P.gingivalis降低SD大鼠学习记忆能力并促进AD样病理改变 与对照组相比,水迷宫定位航行实验发现P.gingivalis高剂量组在第5天时SD大鼠学习能力下降,差异具有统计学意义（P=0.017）,低剂量组无显著性差异。水迷宫空间探索实验发现P.gingivalis高剂量组SD大鼠记忆能力下降,差异具有统计学意义（P=0.001）,低剂量组无显著性差异。新物体识别实验发现P.gingivalis高剂量组降低SD大鼠学习记忆能力,差异具有统计学意义（P=0.001）,低剂量组无显著性差异。苏木精-伊红染色发现P.gingivalis导致大鼠海马体及大脑皮层神经元排列疏松、空泡性变,免疫组化染色结果发现P.gingivalis促进SD大鼠海马体Aβ1-42样物质生成。2.P.gingivalis增强SD大鼠BBB及体外BBB模型通透性 伊文斯兰BBB通透性实验检测发现P.gingivalis高剂量组伊文斯兰颜色沉积加深,低剂量组未见明显改变。Western blot检测发现P.gingivalis高剂量组及低剂量组海马体白蛋白及纤维蛋白原蛋白水平升高,差异具有统计学意义（P=0.002,P=0.001,P=0.037,P＜0.001）。在大鼠大脑皮层中检测发现P.gingivalis高剂量组中白蛋白及纤维蛋白原蛋白水平升高,差异具有统计学意义（P=0.019,P=0.012）,低剂量组无显著影响。透射电子显微镜结果发现SD大鼠海马体微血管中及脑实质内能够观察到类P.gingivalis菌体样物质。进一步通过体外BBB模型检测发现P.gingivalis能够穿过体外BBB模型,并增强b End.3细胞通透性（P=0.026）。3.P.gingivalis促进脑微血管内皮细胞转胞吞作用途径进而增强BBB通透性（1）高通量结果分析显示,P.gingivalis感染b End.3后差异基因1661个,上调983个,下调678个。GO功能富集分析结果显示,差异基因功能富集主要集中于膜功能。COG功能分析显示其主要富集于细胞内运输、分泌及囊泡转运（转胞吞）途径。（2）TEM观察可见,在P.gingivalis感染SD大鼠海马体及大脑皮层脑微血管内皮细胞周围可见囊泡转运增强,部分囊泡呈现为50-100 nm大小的胞膜窖结构,并且大鼠海马体及大脑皮层血管壁结构未见明显破坏。在b End.3细胞中同样发现P.gingivalis周围囊泡增多及胞膜窖结构。免疫组化染色发现P.gingivalis促进SD大鼠海马体及大脑皮层Cav-1蛋白表达（P=0.039,P=0.021）,Western blot检测发现P.gingivalis低剂量组、高剂量组不改变海马体及大脑皮层紧密连接蛋白OCLD表达（P=0.094,P=0.369,P=0.535,P=0.989）。转染si RNA抑制Cav-1表达后,b End.3细胞内细菌内化数量及细胞通透性下降,差异具有统计学意义（P=0.03,P=0.017）。（3）免疫荧光染色可见P.gingivalis促进b End.3细胞膜表面Cav-1表达,并与其共定位。质谱分析筛选与Cav-1互作的P.gingivalis毒力因子共有26个,除去未知功能肽段外,筛选出较高覆盖率P.gingivalis-精氨酸牙龈蛋白酶（arginine-gingipains,Rgp）。计算机分子模拟Cav-1与Rgp A蛋白对接情况发现两个蛋白结合比较紧密,并且部分位点已经以氢键得形式发生了结合。4.P.gingivalis通过Mfsd2a/Cav-1途径增强BBB通透性聚类分析及后续Western blot验证发现P.gingivalis显著下调转胞吞途径关键分子Mfsd2a表达（P=0.04）,激光共聚焦显微镜观察可见P.gingivalis显著抑制脑血管中Mfsd2a表达。通过si RNA干扰技术敲低Mfsd2a后,b End.3细胞内细菌内化数量及细胞通透性增加,差异具有统计学意义（P=0.001,P=0.028）。过表达Mfsd2a后,b End.3细胞内细菌内化数量及细胞通透性下降,差异具有统计学意义（P=0.005,P=0.011）。并且过表达Mfsd2a后,b End.3细胞内Cav-1蛋白水平下降（P=0.004）。结论:1.P.gingivalis降低SD大鼠学习记忆能力,促进AD样病理改变并增强BBB通透性。2.P.gingivalis能够增强脑微血管内皮细胞转胞吞作用,并且上调Cav-1蛋白水平、抑制Mfsd2a蛋白水平。Mfsd2a/Cav-1是P.gingivalis调控脑微血管内皮细胞转胞吞作用及通透性增强的关键分子。3.Cav-1可能与P.gingivalis毒力因子Rgp A结合,从而介导P.gingivalis与Rgp转运至脑内进而促进AD发生。