siRNA沉默Twist基因对Caski细胞化疗增敏的研究

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背景:胚胎发育基因Twist属于高度保守的碱性螺旋-环-螺旋(basichelix-loop-helix,bHLH)结构的转录因子家族,具有癌基因的特征,不仅参与肿瘤的发生、发展,而且与肿瘤细胞对化疗不敏感、产生耐药性密切相关。肿瘤细胞出现化疗敏感性降低、产生耐药现象是肿瘤临床化疗效果不佳的关键性问题,明确其中可能的原因及机制对提高临床化疗疗效具有深远的意义。因此,本课题主要研究了沉默Twist基因增加了宫颈癌细胞对紫杉醇的化疗敏感性,为提高宫颈癌化疗疗效以及其临床治疗效果提供新思路。目的:沉默宫颈癌细胞中的Twist基因,并予紫杉醇预处理,研究其增殖、克隆、凋亡、细胞周期的情况,揭示沉默Twist基因是否可提高宫颈癌细胞化疗敏感性。方法:1、体外培养宫颈癌Caski细胞和Hela细胞,用半定量PCR及荧光定量PCR检测两种细胞中Twist基因mRNA的表达,筛选出表达高者为合适的实验细胞株模型;2、设计并化学合成两对靶向Twist基因的siRNA(siRNA1、siRNA2)及一对与任何基因无同源性的阴性对照siRNA(NC),利用LipofectamineTM2000将各组siRNA转入宫颈癌Caski细胞中,荧光定量PCR检测Twist mRNA表达,筛选出沉默Twist基因效果最佳siRNA;3、瞬时转染Caski细胞,予0.001、0.01、0.1、1、10umol/L5种不同浓度紫杉醇溶液作用,MTT法检测细胞增殖情况及半数抑制浓度(IC50);克隆形成实验检测克隆形成能力;流式细胞学术检测细胞凋亡和细胞周期情况。结果:1、Caski细胞中Twist基因表达较Hela细胞中高,其差异具有显著性(p<0.05)。2、在36h、48h、60h不同时间点,转染siRNA1、siRNA2的两组Caski细胞中Twist mRNA表达抑制率分别为20.3%、38.2%、33%;24%、68.6%、50.8%。转染siRNA1、siRNA2组的RQ值较阴性对照组明显降低,尤以siRNA2组显著(p<0.01),且在转染48h明显,其差异有统计学意义(p<0.05)。3、在5种不同浓度紫杉醇作用48h后,转染效率最佳的siRNA2组(记为si-Twist组)细胞生长抑制率明显高于阴性对照组(NC-Twist组)及空白对照组(Mock组),且生长抑制率呈浓度依赖性(p<0.05);si-Twist组、NC-Twist组、Mock组各组半数抑制浓度(IC50)分别为1.00±0.13umol/L、32.82±3.25umol/L、48.33±3.54umol/L,si-Twist组IC50值明显低于其他两组(p<0.05);在1umol/L(IC50)紫杉醇作用各组Caski细胞不同时间后,si-Twist组细胞生长抑制率明显高于NC-Twist组及Mock组,以作用24-48h显著(p<0.05)。4、1umol/L紫衫醇作用后,si-Twist组、NC-Twist组克隆形成率分别为8.20±0.71%、21.00±2.12%,si-Twist组克隆形成能力明显低于NC-Twist组,其差异具有统计学意义(p<0.05)。5、1umol/L紫衫醇作用后, si-Twist组、NC-Twist组凋亡率分别为43.21±6.19%、26.16±5.89%,si-Twist组凋亡率明显高于NC-Twist组,其差异显著(p<0.05);si-Twist组细胞周期分布G0/G1期、S期、G2/M期分别为56.50±6.33%、21.59±2.54%、21.90±3.71%,NC-Twist组细胞周期分布G0/G1期、S期、G2/M期分别22.70±3.48%、29.12±1.55%、48.18±3.97%,沉默Twist基因组细胞周期以G0/G1期阻滞为主(p<0.05)。结论:1、Twist基因在Caski细胞株中高表达。2、沉默Twist基因,可抑制Caski细胞增殖及克隆形成能力,促进其凋亡,从而提高Caski细胞的化疗敏感性。
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