3株放线菌的分离鉴定及其遗传转化系统的构建与优化

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:william_wng
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土壤微生物链霉菌是天然抗生素的重要来源,通过对土壤微生物链霉菌进行了分离、鉴定、遗传转化系统的构建及转录因子的功能研究,有助于挖掘其独特的微生物资源和生物合成潜能,为重要基因簇功能的研究和开发在医药和农业等领域迫切需要的药物奠定基础。  本研究以内蒙古赤峰宁城县青山林场土样为材料,共分离得到63株盐碱地放线菌。分别对这63株菌进行生物活性检测,共获得7株抑菌效果较好的菌株。然后对这7株放线菌进行遗传转化系统的构建,其中3株放线菌的遗传转化系统构建成功。  对构建好遗传转化系统的3株放线菌S-5、S-27和S-28进行菌种鉴定,包括形态观察、培养特征、生理生化及16S rDNA鉴定,最后初步鉴定这3株链霉菌S-5、S-27和S-28分别为Streptomyces alogtiseolus、treptomyces albus和streptomyces bacillari。  通过接合转移的方式对3株链霉菌S-5、S-27和S-28进行遗传转化系统的构建,且3株链霉菌遗传转化系统均构建成功。对其中一株链霉菌S-28的接合转移系统进行优化,包括:培养基的选择、抗生素浓度、MgCl2的浓度、S-28孢子热激条件、预萌发时间、供受体比例和接合时间等条件,最后确定了S-28菌株接合转移系统的最优条件。  经基因组草图测序分析,S-28菌株全基因组全长大约7,864,237bp,共获得91个scaffolds,93个contigs,GC含量为71.95%。软件预测CDs有6,882个,通过多种数据库对所得基因进行功能分类与注释,以及antiSMASH在线分析,共有38个基因簇,表明该菌株含有较为丰富的次级代谢产物资源,有较高的开发利用价值。  采用基因置换和框内缺失技术,对bldA基因和Ectione基因簇的MarR转录因子进行基因敲除,并对MarR转录因子进行异源表达。结果:成功表达了MarR转录因子蛋白。利用接合转移的方法,将敲除载体pKC1132-L+Kan+R导入到S-28中,经抗性筛选及PCR验证,未获得bldA基因置换菌株Streptomyces bacillaris S-28;将敲除载体pKC1139-L+Kan+R经接合转移导入到S-28中,尚未未获得MarR基因框内缺失菌株Streptomyces bacillaris S-28。
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