肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，恶性程度高，预后差。随着分子生物学的发展，基因治疗给恶性肿瘤的治疗带来了曙光。肿瘤的基因治疗，特别是肿瘤的自杀基因疗法，已经成为继传统的手术切除、放疗、化疗等方法后的一种新的抗肿瘤治疗措施。但单纯自杀基因治疗由于目前载体转染效率较低、靶向性不够等问题没解决，仍有部分肿瘤细胞残余导致肿瘤复发，这是该疗法存在的重大缺陷。因而增强旁杀伤效应目前已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。由于缝隙连接机制是旁观者效应的重要机制，故改善肿瘤的细胞间信息交流(GJIC)是自杀基因疗法增效的重要途径之一。同时，以往的研究证明：六味地黄丸有提高cAMP的作用，而cAMP的提高又能增加Cx蛋白的表达，从而提高GJIC功能而增强自杀基因治疗的旁杀伤效应。本研究应用中药复方血清药理学的方法将自杀基因HSV1-tk／GCV系统与六味地黄丸在体外实验中联合，以大鼠肝癌细胞CBRH7919为对象进行了初步研究。通过研究以期为临床自杀基因疗法联合中药复方的中西医结合治疗方案的建立提供实验数据、科学依据及前期工作基础。目的：本实验旨在以往研究的基础上，应用中药复方血清药理学方法将六味地黄丸和HSVI-tk／GCV系统联合，进行大鼠肝癌细胞CBRH7919自杀基因治疗的体外实验。初步探讨其机制，为建立中西医结合肿瘤基因治疗方案提供必要条件。方法：1六味地黄丸药物血清和空白血清的制备：SD大鼠(230～280g)，分为对照组和六味地黄丸给药组(药物剂量为等效剂量的6～8倍)。灌胃又分为四天血清组和八天血清组。末次给药后1小时腹主动脉取血，-70℃冰箱保存备用。2 HSV1-tk／GCV自杀基因系统的构建(导师课题组在前期工作中已经完成)3 HSV1-tk／GCV系统联合六味地黄丸含药血清治疗疗效观察：MTT法检测大鼠肝癌细胞CBRH7919对GCV的敏感性以及对大鼠血清(对照血清和六味地黄丸含药血清)的敏感程度，以确定用药浓度。选择对细胞抑制率低的浓度进行实验。用金正钧Q值分析六味地黄丸含药血清与自杀基因系统联合作用对旁杀伤效应是否具有协同性。Q值为联合用药时实测药效与理论药效的比值，Q＜0.85为拮抗作用；0.85≤Q＜1.15为相加作用；Q≥1.15为协同作用。4六味地黄丸含药血清对自杀基因治疗系统旁杀伤增效机制的研究：用流式细胞技术检测凋亡指数；SLDT法观察六味地黄丸含药血清对CBRH7919的GJIC功能的影响。结果：1六味地黄丸含药血清联合HSV1-tk／GCV系统治疗结果1．1 GCV的工作浓度在GCV为9.8μM、19.6μM浓度下，CBRH7919／tk~-细胞平均存活率为79.34％、76.64％；而CBRH7919／tk~+细胞只有48.73％、43.84％(二者无显著性差异)；GCV为39.2μM、78.4μM时，CBRH7919／tk~-细胞平均存活率为73.67％、68.05％：而CBRH7919／tk~+细胞只有27.06％、17.49％。鉴于在进行HSV-tk增效药物实验时要尽量避免GCV对tk~-细胞的杀伤作用，同时考虑到大鼠血清对CBRH7919细胞的营养作用以及血清对药物的干扰作用(大鼠血清可干扰GCV对细胞的抑制作用，对细胞起保护作用)，故选择39.2μM的GCV作为工作浓度。1．2血清的制备及含药血清的添加量本实验给药方案采用每天灌胃2次，间隔8小时；灌胃后1h取血。从MTT以及流式的观察结果来看，灌胃八天组的含药血清其效果要好于四天组的血清。对照血清及六味地黄丸含药血清在5％～10％浓度下对大鼠肝癌细胞CBRH7919的生长有促进作用，但是随着血清浓度增高(＞20％)会对细胞的生长产生明显的抑制作用，镜下观察细胞形态发生空泡状改变。说明大鼠血清本身对肝癌细胞有促生长作用。但六味地黄丸含药血清与对照血清对细胞影响无统计学差异(P＞0.05)。1．3 HSV1-tk／GCV治疗中tk~+：tk~-细胞最佳比例的筛选实验证明：10％tk~+混合比例下药物可作用空间比较大，有利于观察含药血清对旁杀伤效应的诱导促进作用。1．4六味地黄丸含药血清对tk~+／GCV系统旁杀伤增效作用的量效关系四天含药血清与八天含药血清均能增强HSV1-tk／GCV系统大鼠肝癌细胞CBRH7919的旁杀伤效应，但是其增效作用的时间点是不同的：四天血清孵育6h能观察到二者联合杀伤的协同增效作用；八天血清孵育24h能观察到二者联合杀伤的协同增效作用。2六味地黄丸含药血清对HSV-tk／GCV系统旁杀伤增效机制的研究结果2．1六味地黄丸含药血清联合tk~+／GCV系统对CBRH7919细胞周期和凋亡的结果无论是PI单染色法还是Annexin v／PI双染色法，六味地黄丸含药血清与HSV1-tk／GCV治疗系统联用，都可增加大鼠肝癌细胞的凋亡率。且八天含药血清的药效要稍好于四天血清。PI单染色法：八天血清——含药血清+10％tk~++GCV组的凋亡率比对照血清+10％tk~++GCV组的提高了0.77％；四天血清——含药血清+10％tk~++GCV组的凋亡率比对照血清+10％tk~++GCV组的提高了0.11％。当存在10％tk~+时，GCV／含药血清使细胞的S期比率显著的比tk~-／GCV／含药血清提高近一倍(八天血清)。表示GCV杀伤的细胞增殖加速，但是药物血清未见明显抑制增殖的作用。Annexin v／PI双染色法：八天血清——含药血清+10％tk~++GCV组的凋亡率比对照血清+10％tk~++GCV组的提高了6.0％；四天血清——含药血清+10％tk~++GCV组的凋亡率比对照血清+10％tk~++GCV组的提高了5.7％。2．2六味地黄丸含药血清对CBRH7919细胞的缝隙连接机制初探结果CBRH7919细胞经过六味地黄丸含药血清孵育后，细胞间隙连接通讯功能较对照血清孵育后的获得显著增强。但八天含药血清与四天含药血清相比无明显差异。结论：本研究在细胞水平探讨了六味地黄丸含药血清增强自杀基因疗法疗效的可行性。发现能有效增强自杀基因对肿瘤细胞的杀伤力，提高旁杀伤效应，而且是协同性增效作用。对其机制研究分析表明，其作用机制很可能是通过增强CBRH7919细胞的GJIC或诱导凋亡等来起到增效作用的，也可能是两个机制都起作用。