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PI3K/AKT/mTOR信号通路在癌症的发生和发展中起着重要的作用。胞蛋白激酶2(Casein kinase 2,CK2)是一种高度保守的具有多种底物的胞蛋白激酶,能够参与肿瘤的生长和转移等生命过程。Y-box结合蛋白1(Y-box–binding protein-1,YBX1)在多种恶性肿瘤中高表达,且与肿瘤的过度增殖、耐药性及不良预后密切相关。已有研究表明,CK2α和YBX1均能够调控PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性。此外,通过人体蛋白质参考数据库(Human Protein Reference Database,HPRD)预测,CK2很有可能是YBX1的上游蛋白激酶,能够磷酸化YBX1 165位的丝氨酸。因此,我们推测CK2与YBX1可能存在相互作用,共同调节PI3K/AKT/mTOR信号通路的活性。本课题拟探究CK2α和YBX1在肿瘤细胞中表达的相关性;CK2α对YBX1表达的影响;CK2α和YBX1的相互作用;联合抑制CK2α和YBX1对肿瘤细胞增殖、周期、迁移等表型以及耐药能力的影响。主要研究结果如下:(1)CK2α和YBX1在肿瘤细胞中的表达具有一定的相关性。以三种胃肠道间质瘤细胞系(GIST882,GIST-T1,GIST430)、三种卵巢癌细胞系(SKOV3,ES2,OVCA429)、三种胃癌细胞系(AGS,MKN28,BGC823)、两种肺癌细胞系(PC9,A549)、两种肝癌细胞系(HepG2,Hep3B)为材料,Western blotting结果发现CK2α和YBX1在肿瘤细胞中均存在广泛表达的现象,这表明CK2α和YBX1在肿瘤细胞中的表达可能具有一定的相关性。(2)CK2α能够调控YBX1的表达。以三种胃肠道间质瘤细胞系(GIST882,GIST-T1,GIST430)、三种卵巢癌细胞系(SKOV3,ES2,OVCA429)、一种胃癌细胞系(BGC823)、一种肺癌细胞系(PC9)和一种肝癌细胞系(HepG2)为材料,通过CK2α抑制剂CX4945处理细胞,发现YBX1的表达发生了明显的下调,且呈现浓度依赖性。以三种卵巢癌细胞系(SKOV3,ES2,OVCA429)、一种肺癌细胞系(PC9)和一种肝癌细胞系(HepG2)为材料,通过RNAi技术下调CK2α的表达,结果发现YBX1蛋白的表达也发生了明显的下调。进一步研究发现,在两株卵巢癌细胞(SKOV3,OVCA429)、一种肺癌细胞系(PC9)和一种肝癌细胞系(HepG2)中上调野生型CK2α蛋白的表达增加了肿瘤细胞中YBX1蛋白的量,而上调突变型K68M-CK2α蛋白(K68位点的突变缺失激酶活性)的表达对YBX1的表达没有明显的影响。以上结果表明,CK2α能够调控YBX1的表达且依赖其激酶活性。(3)CK2α通过影响YBX1的转录调控YBX1蛋白的表达。在293T和HeLa细胞中上调野生型CK2α蛋白的表达,qRT-PCR结果显示YBX1的转录发生了明显的增加;而上调K68M-CK2α蛋白的表达对YBX1的转录没有明显的影响。荧光素酶报告基因活性检测结果发现,在293T和HeLa细胞中上调野生型CK2α蛋白的表达,明显的增加了YBX1启动子的活性,而上调K68M-CK2α蛋白的表达对YBX1启动子的活性没有明显的影响。以上结果表明,CK2α可能在转录水平调控YBX1蛋白的表达,且依赖其激酶活性。(4)CK2α与YBX1存在相互作用。以293T细胞为材料,将CK2α和YBX1分别构建在pCDNA3.1载体上转染细胞,进行外源性的Co-IP实验。结果发现,CK2α蛋白的免疫亲和物中能够检测到YBX1蛋白的存在;同样,YBX1蛋白的免疫亲和物中也能够检测到CK2α蛋白的存在;以CK2α和YBX1表达量相对较高的GIST882和SKOV3细胞为材料,进行内源性的免疫共沉淀。结果表明,CK2α蛋白的免疫亲和物中能够检测到YBX1蛋白的存在;同样,YBX1蛋白的免疫亲和物中也能够检测到CK2α蛋白的存在。此外,以体外纯化的his-YBX1和CK2α蛋白为材料,进行体外的蛋白质结合实验。结果表明his-YBX1的亲和层析物中能检测到CK2α蛋白的存在。以上结果表明,CK2α与YBX1存在相互作用。(5)联合靶向抑制CK2α和YBX1对肿瘤细胞的影响。以多种肿瘤细胞为材料,我们进一步探究了协同抑制CK2α与YBX1对PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞增殖、周期、迁移能力、体内生长以及耐药能力的影响。Western blotting、细胞活力实验、平板克隆实验、流式细胞术、伤口愈合实验、Transwell migration以及裸鼠皮下成瘤实验结果表明,与单独靶向抑制CK2α或者YBX1相比,联合抑制CK2α和YBX1对PI3K/AKT/mTOR信号通路活性、细胞活力、克隆形成能力、细胞周期、伤口愈合能力、迁移能力、耐药能力以及裸鼠皮下成瘤能力的抑制效果更明显。以上结果表明,协同抑制CK2α和YBX1显著抑制了肿瘤细胞的生长、迁移以及耐药能力。(6)协同靶向调控CK2α和YBX1蛋白的表达对肿瘤细胞的影响依赖于PI3K/AKT/mTOR信号通路。以SKOV3细胞为材料,通过脂质体转染的方式同时上调CK2α和YBX1蛋白的表达,发现与对照组(转染空载体)相比,SKOV3细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路活性、细胞活力和伤口愈合能力均发生了明显的上调。进一步研究发现,用LY294002(PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂)处理后,协同上调CK2α和YBX1蛋白的表达介导的SKOV3细胞的PI3K/AKT/mTOR信号通路、细胞活力和伤口愈合能力增加的现象受到了显著的抑制。这些结果表明,协同靶向上调CK2α和YBX1蛋白的表达对肿瘤细胞的影响依赖于PI3K/AKT/mTOR信号通路。这些研究结果进一步阐释CK2α和YBX1在调控肿瘤发生和发展中的功能,揭示CK2α和YBX1之间的相互作用,研究CK2α和YBX1对肿瘤细胞重要信号通路的调控作用,丰富我们对CK2α和YBX1在癌症中功能的理解。同时揭示了靶向抑制CK2α和YBX1的协同效果可能为开发新的肿瘤治疗靶点提供新的思路。