背景目的神经胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,具有高复发率和死亡率,尽管现阶段手术、放疗和化疗等针对胶质瘤的各种治疗方法得到了有效的发展和进步,但是高级别胶质瘤患者的预后仍然很差,其中位生存期仅为标准治疗后的14.6个月,5年生存率不到10%,为了改善治疗效果,越来越多的研究都集中在发现胶质瘤发展过程中的分子调节机制以及探索有效治疗的靶点上。哺乳动物不孕系20样激酶1(Mammalian Sterile 20 Like Kinase 1,MST1)是抑癌信号通路Hippo信号通路的核心组件,广泛参与细胞凋亡的反应,在调节细胞周期进展和抑制肿瘤发生中的起着重要的作用。研究表明MST1在人体内多种肿瘤中表达异常下调,并且和肿瘤临床分期、病理级别及患者预后呈相关性。但在神经胶质瘤中MST1的表达并不像在其它肿瘤中一致下调,有研究显示MST1的蛋白在胶质瘤中的表达相对于正常脑组织差异明显,高低表达都存在,所以迄今为止MST1在胶质瘤中的表达情况及与临床病理参数、患者预后的关系仍不明确。研究表明由DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase1,DNMT1)介导的DNA甲基化能导致许多关键抑癌基因表达的沉默;转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)可以促进神经胶质瘤细胞的生长,并与胶质瘤的恶性程度相关,在肺纤维化、前列腺癌、肺癌中研究发现TGF-β可以调节DNMT1的表达,因此我们推测在胶质瘤中MST1的表达下降,并且和肿瘤病理级别和患者预后相关;MST1表达下调机制为TGF-β上调DNMT1的表达,继而DNMT1介导MST1甲基化引起其表达下调,并引起胶质瘤细胞的增殖和侵袭。为此本研究通过免疫组织化学法检测胶质瘤标本中的MST1的表达情况,并分析MST1的表达与临床病理参数以及患者预后之间的相关性;然后在胶质瘤细胞中检测TGF-β和DNMT1对MST1表达以及相应的细胞增殖、侵袭的影响,探讨三者之间的关系,旨在验证上述推测,明确MST1在胶质瘤中表达情况,以及其调控的分子机制,为了解胶质瘤的发生、发展过程中的分子机制及分子靶向治疗提供理论依据。方法1.选取安徽医科大学第二附属医院神经外科2009~2016年收集的120例胶质瘤及5例正常脑组织石蜡标本,并收集相应的临床和随访资料,应用免疫组织化学法检测其中的MST1的表达;采用卡方检验分析MST1的表达与临床病理参数之间的相关性;采用Kaplan-Meier及log-rank检验分析MST1的表达和胶质瘤患者预后的相关性。2.采用外源性的TGF-β、5-Azad C(5氮杂-2-脱氧胞苷,5aza-2-deoxycytidine)作用于人胶质瘤U251和U87细胞24h和48h后,采用实时定量PCR及Western Blot分别检测MST1及DNMT1的m RNA和蛋白的表达情况;然后把U251和U87细胞按照药物处理情况分为3组:1)对照组(control):不加药物,加入PBS工作液;2)TGF-β组:加入TGF-β,药物浓度5ng/m L;3)TGF-β+5-Azad C组:加入5ng/m L的TGF-β,24h后再加入5umol/L 5-Azad C,培养48h后采用实时定量PCR及Western Blot分别检测三组中U251和U87中的MST1的m RNA和蛋白的表达情况,并采用CCK8和Transwell检测三组中U251和U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力。构建DNMT1基因的重组慢病毒载体质粒p FH1UGW-sh RNA-DNMT1和阴性对照的重组慢病毒载体质粒p FH1UGW-sh RNA-NC,分别感染胶质瘤U251和U87细胞,首先采用实时定量PCR及Western Blot分别检测慢病毒感染后U251和U87细胞中DNMT1及MST1的表达情况,检测DNMT1基因沉默的效率和沉默DNMT1后MST1的表达情况;U251和U87胶质瘤细胞分为3组:阴性对照组(sh Con),TGF-β+sh Con组,sh DNMT1+TGF-β组;采用实时定量PCR和Western blot检测三组中U251和U87细胞中MST1的m RNA和蛋白的表达水平;采用CCK8和Transwell检测三组中U251和U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力。结果1.MST1在正常脑组织及胶质瘤中的表达。120例胶质瘤标本中检测到MST1呈阳性表达54例,阴性表达66例,阳性表达率为45.0%;5例正常脑组织中检测到MST1呈阳性表达5例,阳性表达率为100%,MST1阳性表达信号主要存在于细胞质中。2.MST1的表达与胶质瘤患者的临床病理参数之间的相关性分析。MST1的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、术前KPS评分(Karnofsky performance score)等临床参数无明显相关性;MST1在高级别胶质瘤(Ⅲ~Ⅳ级)中阳性表达21例,阳性表达率33.3%;在低级别的胶质瘤(I~II级)中表达33例,阳性表达率57.9%;在正常脑组织中阳性表达5例,阳性表达率100%,在高级别胶质瘤中的阳性表达率明显低于低级别胶质瘤,二者差异有统计学意义(P=0.007)。3.MST1的表达与胶质瘤患者预后的关系。在120例总体的胶质瘤患者中MST1阴性表达者的中位生存时间为20个月,阳性表达者的中位生存时间为48个月,MST1表达阴性者总生存率较MST1表达阳性者明显降低,两者比较差异有统计学意义(P=0.000)。在63例高级别胶质瘤患者中MST1表达阴性者的中位生存时间为11个月,阳性表达者的中位生存时间为18个月,在高级别胶质瘤中MST1表达阴性者总生存率较MST1阳性表达者明显降低,两者比较差异有统计学意义(P=0.010)。4.TGF-β能下调MST1的表达和上调DNMT1的表达。TGF-β作用U251和U87细胞24及48h后,检测MST1的m RNA和蛋白表达量均明显降低(*P<0.05,**P<0.01),DNMT1的m RNA表达量明显上升(**P<0.01),并且随着TGF-β作用时间的延长,MST1的表达量逐渐下降,DNMT1的表达量逐渐上升,二者均呈现时间依赖性。5.5-Azad C能上调MST1的表达,并且能逆转由TGF-β诱导的MST1表达的下降,抑制TGF-β诱导的胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。在U251和U87细胞中加入5-Azad C作用48h,MST1的m RNA和蛋白表达量明显上升(**P<0.01)。TGF-β组中的U251和U87细胞的MST1的m RNA和蛋白的表达量均明显低于正常对照组(**P<0.01);TGF-β+5-Azad C组中的U251和U87细胞的MST1的m RNA和蛋白的表达量均明显高于TGF-β组(##P<0.01);TGF-β组中U251和U87细胞的增殖、迁移、侵袭能力较对照组(control)明显升高(**P<0.01),TGF-β+5-Azad C组中的U251和U87细胞的增殖、迁移、侵袭能力较TGF-β组明显下降(##P<0.01)。6.慢病毒介导的DNMT1沉默能上调MST1的表达,逆转由TGF-β诱导的MST1表达的下降,并且抑制TGF-β诱导的胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。成功构建了针对DNMT1表达的特异sh RNA(Lv-sh DNMT1)及阴性对照(Lv-sh Con)的慢病毒载体系统,并感染U251和U87细胞,Lv-sh DNMT1感染的U251和U87细胞中DNMT1的m RNA和蛋白表达水平较阴性对照sh Con明显减少(**P<0.01),DNMT1基因的沉默效率较高;U251和U87细胞的MST1的m RNA和蛋白表达水平较阴性对照sh Con明显升高(**P<0.01);TGF-β+sh Con组中的U251和U87细胞的MST1的m RNA和蛋白的表达量均明显低于正常对照组(**P<0.01),sh DNMT1+TGF-β组中的U251和U87细胞的MST1的m RNA和蛋白的表达量均明显高于TGF-β+sh Con组(#p<0.05,##P<0.01);TGF-β+sh Con组U251和U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力较对照组(sh Con)明显升高(**P<0.01),sh DNMT1+TGF-β组中的U251和U87细胞的增殖、迁移及侵袭能力较TGF-β+sh Con明显下降(#p<0.05,##P<0.01)。结论1.MST1的表达与患者的年龄、性别、肿瘤大小、术前KPS评分等临床参数无明显相关性。2.MST1的表达与肿瘤病理级别相关,在高级别胶质瘤的阳性表达率明显低于低级别胶质瘤。3.MST1的表达与患者预后相关,MST1表达阴性者总生存率较阳性表达者明显降低。4.在神经胶质瘤细胞中TGF-β通过上调DNMT1的表达,继而通过DNMT1介导的表观遗传抑制引起MST1的表达下降,并促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭。