论文部分内容阅读
目的:研究不同剂量亚砷酸钠慢性饮水染毒大鼠肝脏纤维化情况,寻找差异蛋白为进一步阐明砷致肝纤维化毒作用机制奠定基础。方法:将40只健康8周龄无特定病原体(Specefic pathogen Free,SPF)Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠随机分为4组,分别为对照(去离子水)组及0.68、1.36、2.73mg/kg亚砷酸钠(iAs3+)染毒组。采用自由饮水方式进行染毒,连续染毒24周。收集24h尿样、血样,摘取肝脏,采用高效液相色谱-氢化物发生原子荧光光谱(HPLC-HGAFS)法测定大鼠肝脏及尿液总砷含量。采用酶联免疫分析法(ELISA)测定肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和肝纤维化指标。制作肝组织切片,苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色,光镜下观察病理变化情况,电子显微镜下观察细胞微结构变化。基于相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)的8标实验,结合2D LC-MS/MS对中、高剂量组与对照组大鼠肝脏组织蛋白表达差异进行比较。结果:1.亚砷酸钠染毒20周时高剂量组大鼠体重小于对照组(P<0.05),24周时高剂量组大鼠体重小于对照组、低剂量组、中剂量组(P<0.05),其余组间差异无统计学意义(P>0.05)。2.中、高剂量组大鼠肝脏器系数与正常对照组相比升高,差异有统计学意义(P<0.05),高剂量组与低剂量组肝脏器系数相比差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组与中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。3.光、电镜下观察低剂量组未见明显的形态学改变,中、高剂量组随染毒剂量升高肝纤维化病变明显。4.UAs水平随染毒剂量增高而升高,其中,低、中、高剂量组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),低剂量组UAs高于对照组,中剂量组高于低剂量组,高剂量组高于中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。LAs组间差异有统计学意义(P<0.05),随染毒剂量的增加,LAs水平升高,低剂量组LAs高于对照组,中剂量组高于低剂量组,高剂量组高于中剂量组,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.AST与ALT组间差异有统计学意义(P<0.05),其中AST低剂量组与对照组差异无统计学意义;中、高剂量组均高于对照组和低剂量组(P<0.05),中、高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。ALT低、中、高剂量组高于对照组,低剂量组与中剂量组ALT含量差异无统计学意义(P>0.05),其余组间比较均有统计学意义(P<0.05),高剂量组高于低、中剂量组(P<0.05)。6.“肝纤四项”指标组间差异有统计学意义(P<0.05),两两比较发现HA、PCⅢ、LN三项指标均表现为低剂量组与对照组差异无统计学意义;中、高剂量组均高于对照组和低剂量组,差异有统计学意义,且高剂量组高于中剂量组(P<0.05)。Ⅳ-C中、高剂量组高于对照组和低剂量组(P<0.05),其余组间差异无统计学意义(P>0.05)。7.iTRAQ技术结合2DLC-MS/MS技术选取蛋白质的置信阈值(Unused Prot Score)>1.3,至少有1条匹配肽段在95%置信区间内作为蛋白质鉴定结果,鉴定到2948种蛋白质。文氏图比较发现三组均检测到的为2162种,除去对照组中也有意义的差异蛋白中剂量组上调蛋白为687种,下调为548种;高剂量组上调为633种,下调为519种。中、高剂量组表达差异蛋白数量,差异没有统计学意义(P>0.05)。8.与甲基代谢相关的差异蛋白AS3MT、SHMT、BHMT、线粒体内CHDH、CTH以及CSAD,在中、高剂量组均上调;MTR有2种蛋白,其中METK1上调,F1LRB8下调,但高剂量组蛋白表达差异无意义。与GSH相关蛋白18种,包括Gsta1、Gsta4、Gsta5、Gstt1、Gstt2、Gstk1、Gstp1、Gstm1、Gstm2、Gstm3,Gss、Gpx1、Gpx4、Esd、Hagh、Glo1、Mgst1、B6DYQ5表达均上调;与肝纤维化有关的蛋白有Hic-5、Gss、Tpm,其中Tpm有6种包括Tpm1三种、Tpm2两种、Tpm3一种,表达均上调。结论:慢性砷暴露后砷在肝脏有蓄积,导致肝脏纤维化改变且肝功能下降,肝纤维化大鼠AS3MT、MTR、MAT、SHMT、BHMT、CHDH、CTH、CSAD、Hic-5、GSH、GSS、TPM高表达,可能在砷代谢和肝纤维化中发挥重要作用,与肝纤维化的发生相关。