目的:黄芪(Astragalus membranaceus,AM)作为一种传统中药,具有增强免疫、调节代谢、抗氧化、抗肿瘤等多种药理学作用。近来的研究表明黄芪具有较强的抗炎活性,其抗炎机制有待深入研究。炎症反应是机体固有的防御机制,但过激和持续的炎症能够造成不可逆的损伤,甚至危及生命。单纯的抗炎药物治疗可引起免疫失衡,且常伴有不良反应。黄芪具有免疫调节和抗炎的双重作用,且副作用低,满足于现代抗炎治疗的新需求。黄芪注射液作为一种标准化的黄芪提取物已应用于心血管系统、肾脏等疾病的临床治疗中。本课题通过脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)处理建立小鼠炎症模型和巨噬细胞模型,观察黄芪注射液的抗炎作用,并在LPS刺激的巨噬细胞模型上探索黄芪发挥抗炎作用的分子机制,以期为黄芪注射液在临床抗炎中的应用提供参考,为揭示黄芪的药物作用机理增加更多的研究基础。方法:1.小鼠尾静脉注射LPS建立炎症动物模型,不同剂量的黄芪注射液从尾静脉给药后,观察小鼠体重、脾、肺的改变,ELISA检测小鼠血清中炎症细胞因子IL-1β和IL-6的水平,评价黄芪注射液在体内实验中的抗炎效果。2.采用不同浓度的LPS和黄芪注射液处理小鼠巨噬细胞ANA-1,ELISA法检测细胞培养上清液中IL-1β和IL-6的水平,Western-blot法检测细胞内NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-6的水平,分析黄芪注射液在体外炎症细胞模型的抗炎作用。3.分别用LPS、黄芪注射液及两者联合干预小鼠巨噬细胞ANA-1后,进行转录组测序,通过组间差异基因、GO、KEGG Pathway、STRING等分析,寻找LPS所致炎症反应的基因变化规律和分子机制,以及黄芪注射液发挥抗炎作用的分子基础和信号通路信息,为进一步实验研究提供方向。4.分别用不同浓度LPS、黄芪注射液干预小鼠巨噬细胞不同时间,用免疫荧光染色法标记细胞内自噬标志性蛋白LC3和P62,用免疫荧光显微镜观察LC3的点状聚集和p62的水平,用高内涵成像分析系统计算细胞内p62的平均荧光强度;用LPS及LPS联合PI3K/Akt/m TOR通路的抑制剂LY294002和Torin 1干预ANA-1细胞,用Western-blot法检测细胞内LC3的型别转换和p62的降解水平,研究LPS对细胞自噬及信号通路的影响。用AM干预ANA-1细胞,用Western-blot法检测细胞内LC3的型别转换、p62的降解水平及AMPK的磷酸化水平,研究AM对细胞自噬及信号通路的影响。5.分别用不同浓度AMPK通路的激活剂AICAR及LPS干预ANA-1细胞,用Western-blot检测细胞内p-AMPK、IL-6的水平;用si RNA干扰AMPK的表达,通过Western-blot法观察LPS、AM处理对细胞内AMPK、p-AMPK、p-m TOR、Beclin 1、LC3及IL-6的变化,评价AMPK的活化水平对黄芪注射液发挥抗炎作用的影响。6.采用自噬抑制剂3-MA、自噬激活剂雷帕霉素干预LPS刺激的ANA-1细胞,用si RNA干扰自噬相关基因ATG5的表达,通过Western-blot法观察细胞内ATG5、LC3、p62、IL-6的变化,进一步评价自噬水平对黄芪注射液发挥抗炎作用的影响。7.在STITCH网站预测黄芪注射液中的几种主要成分能否与AMPK结合。用不同浓度的芒柄花素与LPS干预ANA-1细胞,用Western-blot检测细胞内p-AMPK、IL-6、NLRP3、IL-1β的水平,分析芒柄花素的抗炎作用。结果:1.在LPS引起的小鼠炎症模型上,黄芪注射液改善了LPS引起的小鼠体重降低、脾肿大及肺部出血等症状,同时降低了LPS刺激的小鼠血清中IL-1β和IL-6的水平。在巨噬细胞炎症模型上,黄芪注射液降低了细胞培养液上清中IL-1β和IL-6的水平和细胞内NLRP3、IL-1β和IL-6的水平,抑制了Caspase-1的活化。2.转录组学分析显示,LPS组与mock组显著差异基因(differential expression gene,DEG)中差异显著性和差异变化最大的是炎症分子相关基因,包括炎症细胞因子IL-1、IL-6、TNF、IFN等,趋化因子及受体Ccl5、Ccr7等,急性时相反应蛋白Saa3,Thbs1等。GO富集分析显示大部分的基因分布在压力应激方面,涉及141个基因,其次是免疫系统程序方面有113个基因。LPS组与mock组两组间DEG中炎症分子间位于交互作用中心的是IL-6。IL1α、ccl12、ccl7、ccr7、IL27多个因子表现为对IL-6激活作用,IL-6是位于调控的下游的炎症细胞因子。LPS处理使IL-1β、IL-6、NLRP3炎症蛋白对应的基因IL1b、IL6、Nod1、Nod2基因水平发生显著上调,与细胞实验蛋白水平结果相符。LPS+AM组与LPS组显著差异基因的GO富集在基因转录后调控、m RNA结合、m RNA稳定性调节和m RNA的去稳定性方面,KEGG Pathway富集在核糖体、PPAR及自噬方面。LPS组与mock组的DEG和LPS+AM组与LPS组的DEG的交集中基因KEGG Pathway富集在自噬通路。3.LPS抑制了ANA-1细胞LC3的型别转换和p62的降解,具有时间和剂量依赖性。LPS以剂量依赖方式增加了ANA-1细胞内Akt、m TOR的磷酸化水平,PI3K/Akt/m TOR通路的抑制剂LY294002和Torin 1逆转了LPS对自噬的抑制作用。黄芪注射液能够显著激活自噬,并可以逆转LPS对ANA-1细胞自噬的抑制,呈剂量依赖性。黄芪注射液以剂量依赖的方式磷酸化激活了细胞内AMPK,并上调自噬。4.AMPK激活剂AICAR以剂量依赖方式激活了小鼠巨噬细胞内AMPK的磷酸化,抑制了LPS诱导的巨噬细胞内IL-6的表达。AMPK si RNA降低了细胞内AMPK及p-AMPK的水平,增加IL-6的水平。下调AMPK的表达后,黄芪注射液降低LPS引起的IL-6表达的作用被阻断。5.自噬激活剂可以在LPS刺激的巨噬细胞发挥与黄芪注射液类似的抗IL-6产生的作用,而自噬的抑制剂上调了IL-6的表达。自噬起始阶段的关键基因ATG5的缺失阻断了黄芪注射液的抗炎作用。6.STITCH分析显示黄芪注射液成分之一的芒柄花素与AMPK有间接结合作用。芒柄花素以剂量依赖的方式磷酸化激活了巨噬细胞内AMPK,并降低LPS引起的炎症分子NLRP3、IL-1β和IL-6的表达。结论:1.LPS可以引起小鼠及小鼠巨噬细胞炎症反应,黄芪注射液可降低LPS引起体内外的炎症反应。2.LPS引起了小鼠巨噬细胞基因转录组改变,炎症分子的基因变化差异显著性最大。IL-6、IL-1β位于显著性差异的炎症基因相互作用的重要位置,与其他炎症基因的联系最多,且IL-6位于调控的下游。黄芪注射液对LPS的干预引起的差异基因信号通路集中在自噬和PPAR通路。LPS组与对照组比较DEG与LPS+AM组与LPS组比较的DEG的交集中的基因KEGG富集于自噬信号通路。3.LPS可以通过激活Akt/m TOR抑制小鼠巨噬细胞自噬,黄芪注射液可以通过磷酸化AMPK激活自噬,并逆转LPS对自噬的抑制。4.AMPK的磷酸化参与了AM的抗炎作用。5.黄芪注射液通过磷酸化AMPK激活的自噬发挥了抗炎作用。6.黄芪注射液中芒柄花素可以激活AMPK,发挥抗炎作用。