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研究背景及目的Barrett’食管（BE）是指食管下段复层鳞状上皮被化生的单层柱状所替代的一种病理现象,可伴肠化或无肠化,其中伴有特殊肠上皮化生者属于食管腺癌的癌前病变。BE是胃食管反流病的并发症,约0.5-1 %的患者将发展为食管腺癌。越来越多的研究认为,BE起源于食管粘膜基底层的干细胞,BE细胞来源于干细胞更能解释BE细胞的分化。在正常生物体的发育过程中,同源盒基因CDX2对消化道尤其是结肠和小肠上皮的发育起着关键的作用,是BE中肠化诊断的非常有用的标志物。核干细胞因子（nucleostemin,NS）存在于干细胞和肿瘤细胞的核仁中,而在已分化的成体细胞中不表达,其参与干细胞和肿瘤细胞的增殖调控。但NS在BE的发生、发展中作用仍不清楚。在本研究中,我们假设食管干细胞中NS表达减少可能导致CDX2表达的激活,从而导致干细胞向肠型细胞分化,继而形成肠化生。而HT29细胞株可以用来作为不同成分的胃十二指肠返流物对BE发生中细胞和分子事件效应研究的体外模型。为了验证这个假设,我们运用RNAi技术沉默HT29细胞中NS的表达,了解其对CDX2表达的影响,同时也检测了鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholic acid,CDC）孵育HT29细胞后NS与CDX2的表达。研究方法1、根据NS基因序列（ GeneBank NM206826）,通过www.genscript.com网站在线siRNA设计工具,设计三对siRNA,定向插入到质粒pRNAT-U6.1/Neo,抽提质粒并测序鉴定。构建好的三对NS干扰载体分别命名为pRNAi-1, pRNAi-2与pRNAi-3。将细胞种植于6孔板,待细胞融合率达80%90%时,用脂质体介导的基因转染方法将构建好的NS干扰载体与空载体转入HT29细胞,经G418筛选出稳定转染的细胞系。2、采用不同的实验技术检测NS RNAi后HT29细胞增殖能力、细胞周期、克隆形成能力的变化。3、用100μM、500μM、1000μM的鹅脱氧胆酸孵育HT29细胞,分别于0小时、2小时、12小时、24小时后用胰酶消化收获细胞,其中0小时为实验对照组。4、运用RT-PCR与Western Blot法检测HT29细胞中NS与CDX2的表达。结果1、测序结果经比对,插入寡核苷酸序列与设计的靶点序列完全吻合,说明重组载体构建成功,经过G418筛选和克隆挑选,获得稳定转染的细胞株,转染细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。2、MTT实验表明干扰组细胞增殖能力明显低于HT29组和空载体组;平皿克隆形成实验表明干扰组单个细胞形成克隆的能力与HT29组和空载体组相比显著降低;流式细胞生长周期实验表明,与HT29组和空载体组细胞相比,干扰组G0/G1期细胞比例增加,而S期细胞比例下降。3、3条siRNA真核表达质粒均能有效抑制NS的表达,以pRNAi-1作用效果最为明显,pRNAi-1组较阴性对照组及未转染组细胞有CDX2的增强表达。4、CDC孵育HT29细胞后,NS表达降低,CDX2表达增高,且两者的表达与CDC呈浓度与时间依赖性。CDC孵育HT29细胞在100μM的T2、T12、T24时相点与500μM T2、T12时相点,未见CDX2的增强表达,与对照组T0表达相近,NS的表达也与对照组T0表达相近,浓度为500μM时,T24时相点与1000μM T2、T12、T24时相点CDX2浓度呈逐渐增强表达趋势,NS的表达则为逐渐下降,尤其是在浓度为1000μM、T24时相点时,CDX2表达最强,NS表达最弱。结论NS特异性RNA干扰抑制人HT29细胞株体外增殖,并上调CDX2基因的表达;CDC诱导HT29细胞株CDX2的表达增高的同时NS表达下降,与CDC呈浓度与时间的依赖性。NS可能通过调控CDX2的表达参与了BE的发生。