背景HIV感染的自然过程人为划分为急性感染期、无症状期以及艾滋病期。HIV急性感染期(Acute HTV infection,AHI)是指从病毒感染到可检测抗体出现的一段时期。HIV感染早期(Early HIV infection,EHI)包括急性感染期,其特征是病毒快速复制、广泛的免疫应答和免疫破坏及病毒多样性增加。另外,急性感染期HIV病毒载量较高却没有明显临床症状,HIV传播风险更高。急性感染期不仅仅是感染的早期阶段,在流行病学上也有重要意义。因此,要加强对急性感染期及早期感染者的监测和管理。男男性行为者(men who have sex with men,MSM)是HIV感染的主要高危人群之一。有研究报道,在急性期感染监测中,男男性行为者占很大比例。急性感染期无典型临床表现加之男男性行为者的行为特点,如性伴复杂、安全套使用率低等,使得HIV感染和艾滋病从高危人群向普通人群传播的可能性大大增加。人类免疫缺陷病毒 Ⅰ 型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)病毒复制过程中具有极高的变异性。HIV-1感染人体后,变异株在体内大量累积,最终以一群密切相关但又不完全相同的复杂病毒混合种群形式存在,即准种(quasispecies)。准种的变化受宿主内复制的病毒数量所影响,HIV病毒群在个体内会出现异质性以及动态的变化。HIV-1感染者接受抗病毒治疗后,在不同种类和强度药物的选择压力下,病毒、宿主和药物相互影响和作用,HIV-1病毒准种群的组成以及分布也一直处于动态变化的过程之中。探究HIV-1准种群进化受抗病毒治疗的影响,对了解治疗对病毒进化、病毒与宿主免疫作用关系、与抗病毒药物选择关系、分子溯源准确性及疾病进展均有重要意义。急性期感染启动抗病毒治疗,在病毒抑制后可以有较小的病毒储存库,然而,早期感染的前病毒DNA的动力学及准种群变化规律仍然不清楚。本课题组前期成功地将深度测序技术(IlluminaMiseq平台)用于HIV-1暴露后感染溯源调查、准种传播及进化规律的研究,并将通量更高的IlluminaHiseq平台用于丙型肝炎病毒感染溯源调查。为了探讨抗病毒治疗对HIV-1准种群进化规律的影响,本研究旨在优化针对HIV-1衣壳蛋白(gag)、聚合酶(pol)和包膜蛋白(env)基因区片段的IlluminaHiseq深度测序(以下简称Hiseq测序)方法,并尝试用于分析抗病毒治疗急性期感染者的HIV-1准种群变化规律。目的优化针对HIV-1gag、pol、env基因区的Hiseq测序技术并应用于准种群规律分析以探讨HIV-1急性期感染者准种群随抗病毒治疗时间的变化规律。材料和方法1.研究对象在北京佑安医院男男性行为者(menwhohavesexwithmen,MSM)急性期感染者抗病毒治疗队列中选取8人作为研究对象。8人在被诊断为HIV-1急性期感染后立即启动抗病毒治疗,对基线及治疗后第2、4、8、12、24、36、48、72、84、96周的血液样本(用乙二胺四乙酸二钾抗凝剂抗凝)进行随访检测。每次取部分血液样本进行CD4细胞、HIV-1病毒载量等检测,其余的分离外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)和血浆保存备用。2.实验方法从基线血样PBMC样本中提取DNA,进行HIV-1基因亚型分析:按常规方法分别对HIV-1gag、pol、env基因区片段进行PCR扩增,产物经纯化后测序,进行基因亚型分析。优化Hiseq测序目的片段PCR扩增所需引物以及反应条件,选择尽可能覆盖多种基因亚型的引物,如有需要可以设计多套引物。从随访血样PBMC样本中提取DNA,进行Hiseq测序目的片段(400bp左右)扩增,分别以HIV-1衣壳蛋白(gag)基因区(910～1294 nt)、聚合酶(pol)基因区(2610～2997 nt)和包膜蛋白(env)基因区(6984～7360 nt)为目的片段进行巢式聚合酶链反应(PCR)。产物经电泳及紫外成像确认,并在一代测序检验无误后,将扩增产物纯化然后混合建立DNA文库,再进行Hiseq测序。Hiseq测序数据进行初期处理后,分别统计出每条独特准种群序列所出现的频数,探讨HIV-1准种群分布情况;剔除频数50以下及重复序列之后分析HIV-1准种群分布,计算基因离散率,并做系统进化树分析。结果1.病毒载量自治疗第4周起开始有样本无法检出,到第24周后全部无法检出。除样本0087直接于治疗第4周无法检出外,其他样本均呈现出快速下降、继而相对稳定、随后再次快速下降的规律。CD4细胞数在治疗第2、4周时有所下降,随后回升。2.基线血样的HIV-1基因亚型分析结果显示,HIV-1基因亚型为CRF01_AE、CRF07_BC亚型的样本分别有3、5份。3.Hiseq测序用目的片段技术优化,env基因区下游设计为两套引物:V3-D1(TGATGTATTACAATAGAAAAATTCTCCTC)和 V3-D2(TGTATTGCAATAGA AAAATTCCCCTC)。4.8份样本在基线、治疗第2～12周gag、pol、env三基因区均扩增成功出Hiseq测序的目的片段(长度均在400bp左右);随治疗时间延长,扩增成功率降低。第84周仅1份样本(0081)三基因区扩增成功,4份样本(0074、0084、0087、0088)三基因区均扩增失败。第96周仅1份样本(0086)三基因区扩增成功,6份样本(0074、0081、0084、0087、0088、0090)三基因区均扩增失败。5.核酸扩增成功的样本全部成功进行了 Hiseq测序,每个目的基因区片段都获得了十万数量级的序列数。6.在基线点,频数最高(最优势)的第一个准种群序列的频数占全部序列频数的比例均高于50%。抗病毒治疗第2～72周,准种群的分布发生不同程度的变化,其中gag、pol基因区频数第一准种群频数所占比例先减小,从第12周起多数增大,而后维持,个别样本于治疗第48周或第72周再次减小。多数样本env基因区第12周以前变动幅度较小,12周以后变化幅度较大,且规律不一。7.样本内平均基因离散率整体稳定,小范围波动。8.各随访时间点与基线点之间的平均基因离散率在前2周增大,随后保持稳定。9.分别选取每份样本三基因区基线及治疗后不同时间点随访样本中频数最高的前20、50及100个准种群序列做系统进化树分析,不同数量准种群序列所显示的规律一致。系统进化树显示,同一 HIV-1感染者不同时间点的准种群序列散在分布且距离接近。结论1.针对HIV-1gag、pol和env基因区的Hiseq测序方法可有效用于分析HIV-1准种群变化规律。2.急性期抗病毒治疗能降低HIV-1病毒载量调定点且延长准种群分散时间。3.在HIV-1病毒载量无法检出时,通过提取前病毒DNA可以获得有效的核酸信息,用于准种群变化规律研究。