1.目的与意义类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种原因不明的、慢性进行性的系统性炎症性疾病。其特点为滑膜增生和外周关节对称性、侵蚀性关节炎,但也可以导致全身系统性表现。RA为常见多发病,国外患病率为0.5%-3%,国内0.3%-0.5%,好发年龄20-45岁,男女发病率比率约为1：3。一般情况下,RA患者都会有持续的滑膜炎、进行性的关节破坏和功能障碍而致残障,长期的病程及最后关节损伤所致的功能障碍给患者及家庭造成极大的痛苦和负担。目前认为RA的病因与遗传、感染、随机和性激素等因素相关。RA的发病机制尚未有确切定论,在RA病程中贯穿了滑膜组织增生、炎症、骨及软骨降解和破坏、关节的进行性破坏、自身免疫等病理生理过程,而且它们之间相互作用、相互关联,形成一个错综复杂的网络。80年代有人提出RA是T细胞介导的自身免疫性疾病,CD4T细胞尤其在RA慢性炎症的启动及持续过程中起主要作用,调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)更是近年对RA的发生发展及机制方面的研究热点。同时越来越多证据显示关节滑膜成纤维样滑膜细胞(RA synovial fibroblasts, RA-SF)对RA发病和迁延具有重要的影响,参与关节软骨和骨破坏；RA-SF具有转化特征,且发生不可逆的转变,在RA进展中,RA-SF既是被动反应又是主动参与；有研究认为RA-SF的大量增殖与细胞周期(增殖、凋亡)失调有关。临床上,用于RA治疗的常用药物主要包括非类固醇抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAID)、缓解疾病的抗风湿性药物(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARD)、激素、针对不同靶向的生物制剂。尽早应用DMARD已成为医学界的共识,甲氨蝶呤、羟氯喹、来氟米特等均是常用药物；而外周血干细胞移植和基因治疗都是RA治疗的发展方向。传统抗RA药的毒副作用较大,而新兴的生物治疗、基因治疗价格昂贵,患者长期服用依从性差,不利于疾病控制。因此研制开发有效、毒副作用小的抗RA药物势在必行。类风湿关节炎属中医的疑难杂症,在长期的中医临床实践中,中药临床治疗效果显著,因此,对临床治疗有效的中药单味药及复方的开发具有重要的意义。过山枫[Celastrus aculeatus Merr]属卫矛科南蛇藤属植物,具有祛风除湿、行气活血、消肿解毒等功效,中国民间常用该药的水煎剂或外敷来治疗风湿痹症,临床上常用于治疗RA并取得良效。研究发现过山枫中主要成分有萜类、黄酮类、醇类等。有研究证实：过山枫乙醇提取物对Ⅱ胶原诱发的RA炎症有显著抑制作用；过山枫乙醇提取物可抑制淋巴细胞增生,同时能使淋巴细胞移动减慢、诱导人T淋巴细胞株CEM-6T细胞凋亡；过山枫乙醇提取物可以显著抑制关节软骨内MMP-3、TMIP-1和MMP-3/TMIP-1的表达,提示过山枫乙醇提取物抗炎、调节免疫作用与调节基质金属蛋白酶作用相关。本课题组前期研究结果证明过山枫乙醇提取物对炎症动物模型具有显著抗炎镇痛作用,对热杀死结核分支杆菌H37Ra (Mycobacterium tuberculosis H37Ra,Mtb)诱导的佐剂性关节炎模型(adjuvant-induced arthritis,AA)的关节炎症及病情进展有显著抑制作用。在医学与药物的研究中,实验动物模型的建立是非常重要的。目前在RA研究中常用的实验动物模型有：Ⅱ型胶原性关节炎(collagenⅡ-induced arthritis,CIA)、AA模型。AA模型症状直观,且炎症是T细胞依赖性,因此常用于关节炎新药筛选和RA自身免疫机制的研究。本课题组前期研究建立了以Mtb诱导SD大鼠AA模型,与临床RA表现症状有较大的相似性,其病情表现及进程与临床类风湿关节炎相近,同时该模型制作方法简单,成模率高,经济实用。过山枫的抗炎及免疫调节作用可能是其治疗RA的重要基础,但是关于过山枫抗RA的药理作用研究和化学成分研究目前国内外报道并不多见。基于上述研究背景,本论文主要工作是采用体外T淋巴细胞增殖实验筛选过山枫效应成分,并观察对细胞凋亡的影响；通过建立合理有效的大鼠RA模型,观察效应成分对RA动物模型抗炎作用及相关药理机制；全面评价过山枫治疗RA的物质基础及作用机制,为临床上开发治疗RA的中药新药提供科学依据。2.实验方法2.1过山枫提取物有效部位的体外筛选及诱导T细胞凋亡实验采用化学提取法对过山枫乙醇提取物进行分离,以体外培养小鼠淋巴细胞增殖实验及MTT比色法对乙醇提取物乙酸乙酯(GSF-A)、三氯甲烷(GSF-B)、石油醚部位(GSF-C)进行活性筛选；采用柱层析分离技术,对筛选的活性部位再进一步分离,得到GSFY-A、GSFY-B、GSFY-C部位。通过体外培养ConA诱导的T淋巴细胞抑制实验,采用T淋巴细胞Annexin V-PI双标记流式细胞术检测淋巴细胞凋亡率。2.2 Mtb诱导SD大鼠AA模型建立采用热杀死结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis H37Ra, Mtb),诱导SD大鼠佐剂性关节炎,并对模型进行客观评价。SPF级雄性SD大鼠24只,随机分为两组,对照组、模型组,模型组大鼠尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期记录两组大鼠的一般体征、体重、足容积、关节炎症、外周血液常规、血液流变学、外周血调节性T细胞、关节滑膜细胞凋亡、关节滑膜病理等指标,评价Mtb诱导SD大鼠AA模型的特点,综合评价该模型的合理性、有效性。2.3过山枫乙酸乙酯部位对AA模型大鼠的抑制作用及相关机制研究SPF级雄性SD大鼠60只,随机分为五组,空白组、模型组、MTX组、过山枫低剂量组、过山枫高剂量组,除空白组以外,其余各组大鼠均在尾根部一次性皮下注射Mtb-矿物油诱导剂,定期记录五组大鼠的一般体征、体重、足容积、关节炎症、外周血液常规、血液流变学、外周血调节性T细胞、关节滑膜细胞凋亡、关节滑膜病理等指标改变,观察过山枫对Mtb诱导SD大鼠AA模型的抗炎、免疫调节作用。3.实验结果3.1过山枫不同提取部位对淋巴细胞增殖抑制作用及对T细胞凋亡的影响过山枫不同极性部位GSF-A、GSF-B、GSF-C及MTX对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著抑制作用,各药物组抑制率与ConA对照组比较均有统计学意义(P<0.05)；其中以GSF-A部位对淋巴细胞增殖抑制作用最显著。以GSF-A部位进行柱层析分离,得到的分离部位GSFY-A、GSFY-B、GSFY-C及MTX对小鼠脾淋巴细胞增殖有显著抑制作用,各药物组抑制率与ConA对照组比较有统计学意义(P<0.05)；其中以GSFY-B的作用最显著。淋巴细胞凋亡实验结果表明,过山枫既可诱导早期凋亡,也可诱导晚期凋亡,但诱导晚期凋亡更明显。过山枫乙酸乙酯部位及其柱层析分离物均能诱导淋巴细胞凋亡,与ConA组比较差异显著(P<0.05), GSFY-B诱导淋巴细胞凋亡的作用尤其显著。过山枫对T淋巴细胞增殖的抑制及诱导凋亡作用一致,提示过山枫诱导凋亡是其抑制T淋巴细胞增殖的机制之一。3.2 Mtb诱导SD大鼠AA模型评价模型组大鼠在Mtb免疫初期一般状态与正常组大鼠无异,在第10-13天逐渐出现炎症信号,在第16-25天四肢炎症逐步达到峰值,肢体行动不灵活,尤其是后足关节及足趾严重肿胀并到后期逐步硬化,甚至跛行。模型组大鼠免疫后从21天开始,体重呈下降趋势；在整个实验周期内模型组体重与正常组比较差异显著(P<0.05)。模型组大鼠免疫后从第10天开始,足趾、足垫、踝关节等部位出现红肿,在25天足部肿胀度达到峰值,并出现关节僵化致残。到后期由于出现肢体障碍的大鼠数量增多,炎症评分达到最高值；模型组大鼠足部肿胀度及关节炎症评分与正常组比较差异显著(均P<0.05)模型组大鼠Mtb免疫后16天,外周血淋巴细胞凋亡率呈倍数升高。在第28天外周血淋巴细胞凋亡率明显下降；血红蛋白含量降低,血小板总数、红细胞压积、全血粘度、血浆粘度均升高,与正常组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。调节性T淋巴细胞测定结果表明,模型组大鼠免疫后28天,外周血CD4+CD25+FOXP3+T细胞占CD4+T细胞的比例、CD4+CD25+T细胞占CD4+T细胞的比例均下降,与正常组比较差异显著(均P<0.05)。模型组大鼠免疫后第16、28天,关节滑膜细胞凋亡减少,与正常组比较差异有统计学意义(均P<0.05)病理切片镜下观察可见：模型组大鼠关节滑膜组织大多数出现典型的病理改变,滑膜有6-10层甚至20层滑膜细胞,呈轻度到中度变性、中度到极重度异常增生不等,呈短绒毛状或指突状；滑膜有大量炎性细胞浸润,并有肉芽组织形成。3.3过山枫乙酸乙酯部位对AA模型大鼠关节炎症的抑制作用及相关机制研究SD大鼠免疫Mtb后,MTX、过山枫药物组大鼠均出现病程中相关炎症表现,但均较模型组症状轻。Mtb免疫后从第21天开始,模型组及各药物组大鼠体重未见增长反而下降；与模型组大鼠比较,过山枫高剂量组体重下降程度较小(P>0.05)。在实验周期内,模型组大鼠关节肿胀度及炎症评分呈明显上升趋势,平均肿胀度及炎症评分均高于其他各组,并且两者的改变趋势基本一致；MTX、过山枫低、高剂量在各个时间点对RA模型多关节炎症及病变程度均有抑制作用。模型组大鼠免疫后16天外周血淋巴细胞凋亡率呈倍数升高。第28天外周血淋巴细胞凋亡率明显下降,MTX、过山枫低、高剂量均能显著促进淋巴细胞凋亡；模型组大鼠外周血血红蛋白含量降低,血小板总数、红细胞压积、全血粘度、血浆粘度均升高,MTX、过山枫低、高剂量能显著改善RA模型大鼠血液常规及血液流变学各项指标；模型组大鼠外周的调节性T细胞比例水平低下,MTX、过山枫低、高剂量能显著提高RA模型大鼠外周的调节性T细胞比例。在实验周期内,RA模型大鼠关节滑膜细胞呈现凋亡缺陷,MTX、过山枫低、高剂量能显著促进RA模型关节滑膜细胞凋亡。模型组大鼠免疫后,关节滑膜组织大多数出现典型的病理改变,包括滑膜衬里层细胞增生、炎性细胞大量浸润、肉芽组织形成等,MTX、过山枫低、高剂量对RA模型大鼠关节滑膜具有保护作用,病理状况得到明显改善。4.结论过山枫不同极性部位对小鼠淋巴细胞增殖有抑制作用,其中乙酸乙酯部位及乙酸乙酯柱层析分离物对T淋巴细胞增殖有显著抑制作用,同时乙酸乙酯部位及其柱层析分离物均对T淋巴细胞凋亡有诱导作用；提示过山枫诱导细胞凋亡的作用是其抑制T淋巴细胞增殖的机制之一。Mtb诱导SD大鼠的佐剂性关节炎模型：该模型材料容易获得,对SD大鼠有较高敏感性,制作方法简单,可重复性强,成功率高；关节炎症及临床表现持续时间长；临床表现与组织学改变与人RA相似；模型的免疫学指标存在明显的细胞免疫异常。该模型可以用于RA的医学研究及抗RA新药筛选研究。体内实验证明,过山枫能够控制AA大鼠炎症进展,抑制AA炎症发展过程中关节滑膜增生、炎性细胞浸润,减轻关节炎症症状,降低炎症严重程度,同时具有免疫调节维持机体免疫稳态的作用,因此对大鼠RA的发生和发展具有明显的抑制作用。过山枫的免疫调节作用可能是其治疗RA的药理作用机制之一。