松材线虫病是由松材线虫引起的一种毁灭性的的森林病害,严重威胁着森林生态安全,并给林业带来巨大的经济损失。马尾松是我国南方主要的乡土针叶树种,为松材线虫主要危害对象之一。马尾松中存在抗病基因型,利用抗病品种代替易感品种是防治松材线虫病最为经济有效的措施,但目前对抗性机制并不清楚。因此,本研究对已经经过严格接种松材线虫试验而选出的不同抗性指数马尾松无性系进行生理生化测定以及解剖结构观察,并运用高通量测序技术,从转录组水平检测高抗与易感马尾松基因型对松材线虫的响应差异,以期了解松脂在马尾松抗松材线虫病中的分子机制,为抗性植株的早期鉴定和选择奠定理论基础。研究主要取得以下成果:(1)通过对不同抗性指数马尾松无性系松脂产量和各组分含量进行分析,共检测出19种松脂组分,单萜类、倍半萜类、双萜类组分含量分别占松脂含量的12.08%、5.16%和79.53%,除α-蒎烯、β-水芹烯、蒈烯、山达海松酸、新枞酸在不同抗性间差异不显著外,其余14种组分均达到显著或极显著水平。抗性指数与产脂量呈显著性正相关(r=0.169),与松脂组分中的莰烯、β-蒎烯、月桂烯、柠檬烯均呈现极显著正相关(r=0.507~0.622),与长叶烯呈极显著负相关(r=-0.420)。这表明可以根据松脂产量或组分含量对马尾松的抗性进行初步判定。未受线虫侵袭时,α-蒎烯在不同抗性无性系之间差异不显著,均值变幅在178~198μg·mL-1之间;不同抗性指数β-蒎烯和柠檬烯含量差异显著,高抗无性系分别是易感无性系的2.11倍和2.42倍;易感无性系长叶烯含量是高抗无性系的1.92倍。受到线虫侵染后,α-蒎烯、柠檬烯、β-蒎烯、长叶烯在不同抗性无性系间达到显著或极显著差异;接种后1d,高抗无性系α-蒎烯显著低于易感无性系,接种后7d-15d,高抗无性系的α-蒎烯含量显著高于易感无性系;接种后1d和7d,高抗与易感无性系的β-蒎烯所占比例之间达到显著差异;高抗无性系的柠檬烯比例显著高于易感无性系,约为后者的1.79倍;易感无性系的长叶烯比例比高抗无性系高13.32%。说明α-蒎烯、β-蒎烯、柠檬烯、长叶烯与马尾松的抗性密切相关,受松材线虫侵袭后起主要防御作用的萜烯类组分通过改变在松脂中比例来发挥效用。(2)对分泌和运输松脂的树脂道结构进行了系统观察,结果表明不同抗性马尾松无性系的树脂道差异显著,受线虫侵袭后高抗马尾松无性系的树脂道面积约为易感无性系的1.4倍。同时对不同产脂量马尾松无性系的树脂道结构进行了观察,发现低产脂量马尾松无性系的树脂道面积比高产脂量无性系低10.83%。受到机械创伤后,高产脂量无性系树脂道面积增幅是低产脂量的2.02倍。由相同的变化趋势可以推测不同抗性无性系与不同产脂量无性系响应刺激的防卫反应可能相似,这从解剖结构上验证了抗性指数与松脂产量呈显著正相关的结论。(3)接种松材线虫后,对不同抗性马尾松无性系针叶内的信号分子(h2o2、o2·-、no、ca2+)含量进行了监测,结果发现,高抗与感病马尾松无性系针叶内h2o2含量在整个侵袭进程中均达到显著性差异,高抗无性系在1d时比易感无性系高14.22%。接种后3d及随后进程中,高抗无性系的h2o2含量均显著低于易感无性系。接种后15d,易感无性系的h2o2含量是高抗无性系的1.7倍;除接种后1d外,在接种后3d~30d,高抗与易感马尾松无性系的o2·-含量之间均达到显著差异水平,接种后3d~15d,高抗无性系比易感无性系的o2·-含量分别高21.27%、26.36%和16.43%,而接种后30d,易感无性系o2·-含量显著高于比高抗无性系43.35%;除接种后7d外,其他时间点的no含量在高抗与易感无性系之间均达到显著性差异。不同抗性马尾松无性系针叶内ca2+含量变化趋势类似,但不同时间点均呈现显著性差异,高抗无性系在接种后1d比易感无性系高15.83%。接种后3d时易感无性系比高抗无性系高27.69%,接种后7d,易感无性系是高抗无性系高1.86倍,接种后15d高抗无性系比易感无性系高23.85%,高抗无性系在接种后30d比易感无性系低41.74%。以上结果表明马尾松受到线虫侵袭后,h2o2、o2·-、no、ca2+等信号分子迅速传递刺激信息,参与系统性防卫反应,是马尾松抗性机制中信号转导途径的重要组成部分。(4)接种线虫后,不同抗性马尾松无性系内源激素(sa、ja)含量差异很大。高抗马尾松无性系与易感无性系针叶内水杨酸含量在不同时间点均达到显著差异,接种后1d和30d,高抗无性系针叶内水杨酸含量分别为易感无性系的2.88倍和2.36倍;在其他时间点,高抗无性系水杨酸含量也显著高于易感无性系,为易感无性系水杨酸含量的1.14~1.68倍。除接种后7d外,不同抗性马尾松无性系针叶内茉莉酸含量均呈现显著性差异,接种后1d和3d时,高抗无性系的茉莉酸含量为分别易感无性系的3.52倍和1.93倍;接种后15d,高抗无性系的茉莉酸含量仅为易感无性系的67.74%;高抗无性系在接种后30d为易感无性系的1.56倍。表明植物内源激素水杨酸和茉莉酸参与了马尾松的防御响应,可能起到调节松脂合成的作用。(5)运用RNA-seq技术,对不同抗性马尾松接种松材线虫后1d、15d和30d的茎段进行转录组测序,共获得80 340条unigenes,平均长度为675 nt,其中50 227个(62.5%)unigenes基因获得了功能注释。采用geNorm、NormFinder和BestKeeper三种方法发现U2af、β-TUB、EF和CAC在高抗和易感基因型不同时间点中表达稳定,为最佳内参基因。在每个时间节点,易感基因型的差异表达基因数量均比高抗基因型的多,且大部分差异基因下调,表明受到松材线虫侵染后,易感植株体内的生理生化变化较为严重。高抗和易感无性系接种后15天时差异表达基因的数量最高分别为371和2 179,而接种后30天时差异表达基因最少。差异基因中与萜类合成相关的基因DXS、HDS、MECPS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-α/β-蒎烯合酶、(-)-柠檬烯合酶、长叶烯合酶、Δ-芹子烯合酶和CYP720B等在接种松材线虫后表达量皆发生了显著变化;其中DXS、HMGR、(-)-α-蒎烯合酶、(-)-β-蒎烯合酶、(+)-α-蒎烯合酶、(-)-柠檬烯合酶、长叶烯合酶和CYP720B在接种松材线虫的高抗和易感基因型间差异极显著,意味着这些基因可能与马尾松的抗性有关。另外,病程相关基因、细胞壁相关基因和活性氧(ROS)响应基因以及其它一些抗性基因在高抗或易感基因型中受松材线虫侵袭后表达量也发生显著改变,但仅发现编码PR3和防御素-1的基因在高抗和易感基因型间差异极显著。这些基因在转录组中表达结果与qRT-PCR分析结果一致。差异基因表达情况与松脂组分、信号物质的动态变化相符,说明马尾松接种线虫后,产生系统性防御反应,多种抗性机制共同发挥作用,以抵御线虫的侵袭。