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赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）和黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）作为某些丝状真菌产生的次级代谢产物广泛存在于农作物生产的各个阶段,具有强致癌、致畸、致突变作用,严重威胁着人类和动物的健康。因此对农作物中OTA和AFB1风险物质进行快速检测和有效监控具有重要意义。基于免疫学的真菌毒素分析检测方法具有灵敏、简便快捷等特点,然而以传统单克隆抗体作为免疫识别元件,其繁琐的制备纯化步骤以及高昂成本给商业化免疫检测方法的开发带来沉重负担。纳米抗体（Nanobody,Nb）是目前已知的具有抗原结合能力的最小抗体片段,具有水溶性好、低成本、表达产率高等性质,自身易于基因改造的优势更是赋予了纳米抗体许多有趣的功能和特性,目前越来越多的纳米抗体被应用于食品安全分析、医学诊断等领域。本研究利用原核表达体系和基因工程手段制备了不同功能的抗AFB1和抗OTA纳米抗体,并探究了真菌毒素纳米抗体五聚体在免疫分析方法中的应用。主要研究内容如下:1.基于真菌毒素纳米抗体五聚体建立双重荧光免疫层析方法经原核分别表达抗OTA纳米抗体VHH28和抗AFB1纳米抗体G8与霍乱毒素B亚基（Cholera toxin B subunit,CTB）的融合蛋白,得到两种纳米抗体五聚体。间接竞争ELISA（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定两种蛋白半数抑制浓度(IC50)值分别为0.19 ng/m L和2.60 ng/m L,之后将其作为传统单克隆抗体的替代物,以量子点微球（Quantum dot nanobeads,QBs）作为信号输出元件,构建了纳米抗体五聚体介导的双重荧光免疫层析试纸条,在最优测试条件下,肉眼判读试纸条检测OTA和AFB1的灵敏度分别为0.5 ng/m L和0.75ng/m L。该试纸条与其他真菌毒素无交叉反应,加标实验和储藏稳定性测试结果表明该荧光免疫层析试纸条具有良好的准确度及稳定性,并且在玉米、小麦和大米实际样本检测中该荧光试纸条与UPLC方法的检测结果相一致。2.基于抗OTA纳米抗体五聚体构建均相FRET检测体系在获得抗OTA纳米抗体五聚体的基础上,以量子点（Quantum dots,QDs）作为荧光供体,花状纳米金（Gold nanoflowers,Au NFs）作为受体,构建了以纳米抗体五聚体为抗体识别元件的荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）均相免疫检测体系,分别探讨了供受体抗原抗体标记比例、受体投入体积和均相缓冲液条件对能量转移效率的影响。在最佳条件下,该方法检测灵敏度为5 pg/m L,线性检测范围为5-1000 pg/m L,特异性检验表明该检测方法具有较好的特异性,批内加标回收率为（64.31%-103.45%）,批内变异系数为（0.69%-16.81%）,批间加标回收率为（62.94%-95.00%）,批间变异系数为（1.14%-14.76%）。3.抗OTA纳米抗体与铁蛋白亚基融合蛋白的原核表达及其活性分析分别将抗OTA纳米抗体VHH28融合在铁蛋白（Ferritin,Fep）亚基的C端和N端,构建了p ET15b-Fep-VHH28和p ET15b-VHH28-Fep融合表达载体后将其分别转化至Escherichia coli Rosetta（DE3）宿主菌中诱导表达,得到融合蛋白Fep-VHH28和VHH28-Fep,间接ELISA结果表明只有VHH28-Fep融合蛋白能与OTA-BSA结合,建立基于VHH28-Fep蛋白的间接竞争ELISA标准曲线,其IC50值为2.47 ng/m L。对两种融合蛋白同源建模结果分别与OTA进行分子对接,结果表明VHH28纳米抗体在Fep蛋白亚基两端融合表达后其活性受到不同程度影响。