非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是发病率较高、发病范围较广的常见慢性肝病,其最初表现特征是肝脏脂肪过量沉积。肝脏脂肪沉积（Hepatic fat deposition）不仅严重威胁人类健康,也是养殖鱼类常见肝胆病因,引起肝脏代谢紊乱,给鱼类水产养殖业造成严重的经济损失。早前的研究主要集中于肥胖、高脂等因素诱导的肝脂肪沉积。近几年,越来越多的研究证实饥饿会诱导肝脂肪沉积,加剧非酒精性脂肪肝（NAFLD）的进展,这引起了人类临床和动物实验研究者的广泛关注。但是,目前用于研究饥饿诱导的肝脂肪沉积的动物模型较少,同时饥饿诱导肝脂肪沉积的分子机制尚不清楚。本研究从建立饥饿诱导的斑马鱼肝脂肪沉积模型入手,拟利用转录组和基因敲除技术解析饥饿诱导肝脂肪沉积的分子机制,为解决鱼类肝脏脂质代谢紊乱的问题提供理论基础。为确定斑马鱼（Danio rerio）是否能够用于建立饥饿诱导的肝脂肪沉积模型,本研究首先以野生型斑马鱼为研究材料,在内源营养耗尽开口期5 dpf时设置饥饿组和对照组（正常投食,15 mg/d）,结果表明饥饿会导致斑马鱼仔鱼生长停滞,从10 dpf开始大量死亡,由此确定5-10dpf是观测饥饿诱导斑马鱼肝脂肪沉积的最佳时期。然后,通过对6、7、8和10 dpf时饥饿组和对照组斑马鱼仔鱼整胚油红O（ORO）染色确定肝脏脂肪含量情况,随后在正置显微镜下观察并统计各组仔鱼肝脂肪沉积百分比,通过试剂盒检测斑马鱼仔鱼肝脏中甘油三酯（TG）分别在6、7、8和10 dpf时的含量,同时通过透射电镜观察8 dpf时各组仔鱼肝脏细胞脂质沉积。结果显示饥饿会导致斑马鱼仔鱼肝脂肪沉积,仔鱼肝脏中TG含量显著升高,且TG含量与饥饿时间呈正相关,并在8 dpf时达到峰值。在透射电镜下可观察到饥饿组仔鱼肝脏细胞质中呈现大小不一的脂滴。综上结果表明已成功建立饥饿诱导的斑马鱼肝脂肪沉积模型。为探讨饥饿诱导斑马鱼肝脂肪沉积的分子机制,选取8 dpf时的饥饿组和对照组斑马鱼肝脏进行转录组分析。样本间相关性分析结果表明饥饿胁迫下仔鱼肝组织的基因表达发生了显著变化,其中包括2049个上调基因和2117个下调基因。通过KEGG富集分析发现饥饿对斑马鱼肝脏脂质代谢相关通路有显著影响,主要包括脂肪酸降解、谷胱甘肽代谢途径、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）信号通路、脂肪酸延长途径、脂肪消化吸收、不饱和脂肪酸的生物合成、α-亚麻酸代谢、DNA复制和细胞周期等。此外,通过分析RNA-seq数据发现脂肪酸跨膜转运、β-氧化、从头合成、脂质转运相关基因的表达产生变化。通过鉴定脂肪酸转运体（slc27a1a、slc27a1b、slc27a2a、slc27a4、slc27a6和slc27a6-like）和脂肪酸转位酶（cd36）在各组间的基因表达水平变化。结果显示脂肪酸转运体slc27a1b、slc27a4和slc27a6在饥饿组仔鱼肝组织中表达显著下调,而slc27a2a、slc27a6-like和cd36表达显著上调。通过检测在斑马鱼肝脏组织中表达的11个脂肪酸结合蛋白（FABPs）在饥饿前后基因表达水平变化。结果显示在这些FABPs基因中,有4个基因（fabp1b.1、fabp1b.2、fabp2和fabp7a）与对照组仔鱼相比显著下调。通过KEGG功能注释分析表明饥饿组仔鱼肝组织中参与脂肪酸代谢的大量差异表达基因（DEGs）显著下调,这些基因包括cpt1ab（肉碱棕榈酰转移酶1Ab,肝脏）、cpt1b、cpt2、acox1（酰基辅酶A氧化酶1,棕榈酰）、acox3、acsbg1（酰基辅酶A合成酶泡泡糖家族成员1）、acsl3a、acsl4a、acaa1（乙酰辅酶A酰基转移酶1）、acaa2、acadl（酰基辅酶A脱氢酶长链）、acadm、acadvl、acads、hadhaa（羟酰辅酶A脱氢酶三功能复合酶复合亚单位αa）、hadhab、hadh、hadhb、eci1（烯醇基辅酶Aδ异构酶1）、eci2、acat2（乙酰辅酶A乙酰转移酶2）、aldh3a2b（醛脱氢酶3家族,A2b成员）和aldh9a1b。鉴定了有关调节脂肪生成的主要转录因子和关键酶的表达,结果显示只有dgat1a和dagt1b两个基因表达显著下调,大多数基因的表达不受饥饿的影响（如pparaa、pparg、rxraa、dgat2和fasn）,有3个基因（pparab、rxrgb和scdb）甚至被上调。分析了在斑马鱼中表达的前15位载脂蛋白基因表达差异,包括apoa1b、apoa2、apoa4b.1、apoea、apoc1、apoc2、apo3b、apoa4b.2、apobb.1、apom、apoa4a、apoba、apodb、apoa1a和apoc4。结果显示与对照组仔鱼相比,除apom和apodb外所有基因都显著下调。最后通过检测8 dpf时各组仔鱼肝脏中极低密度脂蛋白（VLDL）含量,结果发现饥饿组仔鱼肝脏中VLDL含量比对照组仔鱼低47.54%,与RNA-seq结果一致。综上通过RNA-seq数据可知,在饥饿条件下,脂肪酸转运体（slc27a2a和slc27a6-like）和脂肪酸转位酶（cd36）显著上调,以促进肝外脂肪酸摄入。饥饿抑制了肝脏脂肪酸代谢途径,但在一定程度上激活了新生脂肪生成途径。更重要的是,饥饿胁迫下许多载脂蛋白基因表达下调,VLDL分泌明显抑制。这些数据表明,饥饿通过促进肝外脂肪酸摄入和脂肪生成,抑制肝脏脂肪酸代谢和脂质转运而诱导肝脂肪沉积。为进一步验证饥饿对肝脏脂质代谢相关基因表达的影响,通过qPCR检测了在斑马鱼肝脏中表达的20个脂代谢相关基因的m RNA相对表达水平。结果显示,大多数候选基因的qPCR结果与RNA-seq序列数据高度一致。这些基因包括上调基因cd36、slc27a2a和scdb,下调基因fabp1b.1、cpt1ab、cpt1b、cpt2、acox1、acaa1、hadhab、apoa1、apoa4.3、apoba、dgat1a和dgat1b。这些结果揭示了饥饿通过调节肝脏脂肪酸摄入、β-氧化、从头合成和脂质转运诱发肝脏脂肪沉积。具体机制为:饥饿通过上调slc27a2a、slc27a6-like和cd36的转录,促进肝外脂肪酸摄取。在肝细胞中,饥饿很可能通过激活PPARα/RXR通路,诱导脂肪生成相关基因（srebf1、srebf2、fasn和scdb）的表达,从而促进肝脏脂肪生成。与此同时,肝脏内脂肪酸代谢途径受到抑制。因此,肝脏摄入肝外脂肪酸大多被用于脂肪生成而不是β-氧化。然而,由于饥饿抑制大量载脂蛋白基因的表达,肝脏合成的脂肪似乎在这里被阻断,由此诱发仔鱼肝脂肪沉积。为探究cd36基因在饥饿诱导的肝脂肪沉积中的作用,本研究使用cd36基因敲除斑马鱼为材料,在5 dpf时设置饥饿组和投喂组（15 mg/d）,同时对5 dpf野生型仔鱼设置同样两组。依前述方法检测了肝脏脂肪含量和肝脂肪沉积百分比,使用试剂盒检测8 dpf时野生型和cd36-/-型仔鱼饥饿组和投喂组肝脏甘油三酯（TG）的含量。结果显示,饥饿会导致野生型斑马鱼肝脂肪沉积,而cd36-/-突变体则未见异常。饥饿3 d和5 d后野生型仔鱼肝脂肪沉积百分率分别为92.12%和93.33%,而饥饿组cd36-/-突变体最高达22.83%。饥饿条件下,8 dpf时cd36-/-型仔鱼肝脏的TG含量比野生斑马鱼低44.09%。以上结果表明,cd36基因敲除可以回救饥饿诱导的斑马鱼仔鱼肝脏脂肪沉积。综上,本研究成功建立了饥饿诱导的斑马鱼肝脂肪沉积模型,初步解明饥饿可通过促进肝外脂肪酸摄入和脂肪酸从头合成,抑制肝脏脂肪酸代谢和脂质转运而诱导肝脂肪沉积,验证了靶向敲除cd36基因可以挽救饥饿诱导的肝脏脂肪沉积。这些结果拓展了对鱼类肝脏脂质代谢紊乱机制的认识,为解决养殖鱼类肝脏损伤提供了思路。同时本研究也阐明了cd36作为靶点的干预作用,为NAFLD的治疗途径提供了新思路。