论文部分内容阅读
目的：多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是由浆细胞的恶性增殖引发的血液系统肿瘤，以贫血、肾功能损害、反复感染、溶骨性骨骼破坏等为临床表现，多发生于中、老年人，男女比例无差异。免疫调节药物是许多恶性血液病治疗方案的基础组成[1]，沙利度胺，最初是用为孕妇镇静剂，因为其致畸性而臭名昭著。早期的研究认为沙利度胺诱导的氧化应激和抗血管生成，可能是其致畸性的作用机制[2,3]。近来在一个拥有里程碑意义的研究提出cereblon（CRBN）是沙利度胺致畸的重要靶点[4]。沙利度胺结合CRBN抑制E3泛素连接酶复合物（由CRBN，DDB1及CUL4构成）的功能。这种复合物调节DNA修复，复制和转录，沙利度胺通过抑制E3泛素连接酶复合物阻止在胚胎肢体发育非常重要的蛋白质（例如下调成纤维细胞生长因子8）的降解导致致畸作用[4]。然而沙利度胺及其相关免疫调节药物IMIDs的致畸作用是否与其抗骨髓瘤的作用有关，最近有研究表明，CRBN的表达是沙利度胺及其沙利度胺衍生物—来那度胺及pomalidomide等抗骨髓瘤活性所必须的[5]。另外，还发现CRBN表达水平下降的MM患者原发抗来那度胺[5,6]。CRBN表达降低没有影响MM患者对其它药物，如硼替佐米，地塞米松和美法仑的反应[4]。最近的一项研究发现MM患者对沙利度胺的维持治疗的反应及对来那度胺结合地塞米松治疗的反应与CRBN的表达水平存在正相关[7,8]。此外，研究者们已经观察到复发和难治性患者CRBN基因突变，这支持在各种IMiDs治疗中CRBN起到关键作用[9]。然而，许多患者低CRBN水平都没有明显的突变，从而转录或转录后因素（如调控的microRNA）可能会影响CRBN基因表达和对IMID治疗的反应能力[10]。本实验通过检测多发性骨髓瘤患者骨髓单个核细胞(BM-MNCs)中CRBN mRNA及蛋白的表达水平，分析CRBN表达水平与多发性骨髓瘤及沙利度胺治疗后临床疗效的关系。方法：本实验通过应用实时荧光定量PCR（Real Time FluorescentQuantitative PCR,Real-Time QPCR）和Western Blot方法，收集河北医科大学第二医院初次诊断的MM患者20例，设为初治组；经治疗后达到PR及以上者30例，设为缓解组。其中20例应用沙利度胺50mg QD治疗，8例应用沙利度胺75mg QD治疗，1例应用沙利度胺100mg QD治疗，1例口服沙利度胺200mg QD治疗；收集20例正常志愿者外周血。应用PT-PCR检测各组单个核细胞(BM-MNCs）中cereblon mRNA表达水平，应用Western方法检测细胞中cereblon蛋白的表达水平。结果：1cereblon mRNA的表达情况RT-PCR结果显示：BM-MNCs中cereblon mRNA在初治组、缓解组、正常对照组的相对表达量分别是：(2.47±1.55)、(1.27±0.60）和(0.65±0.21)。所有MM患者cereblon mRNA的相对表达水平均升高，与正常对照组相比差异均具有统计学意义(p=0.000)；治疗后cereblon mRNA水平较初治组下降但仍高于正常对照组，其差异有统计学意义(p=0.000)。未口服过沙利度胺的患者20例设为1组，口服沙利度胺1-3个月的患者5例设为2组、4-6个月的患者6例设为3组、7-9个月的患者6例设为4组、10-12个月的患者7例设为5组及12个月以上者6例设为6组，各组CRBN mRNA相对表达量分别是(2.47±1.55)、(1.83±0.52）、(1.59±0.45)、(1.58±0.48)、(0.83±0.37)、(0.68±0.19)，各组间CRBN mRNA相对表达量呈下降趋势，其中1组、2组、3组、4组及5组各组之间无统计学差异（p=0.053），2组、3组、4组、5组、6组各组之间无统计学差异（p=0.299）1组与6组比较有统计学差异(p=0.004)。2cereblon蛋白的表达情况Western blot显示：初治组、缓解组、正常对照组的cereblon蛋白的含量分别是：(1.52±0.08) pg/ml、(1.09±0.06) pg/ml、(0.87±0.09) pg/ml。所有MM患者BM-MNCs中cereblon蛋白的含量均升高，与正常对照组比较均具有统计学差异(p=0.000)；缓解组cereblon蛋白水平下降，但仍高于正常对照组，其差异具有统计学意义(p=0.000)。未口服过沙利度胺的患者20例设为1组，口服沙利度胺1-3个月的患者5例设为2组、4-6个月的患者6例设为3组、7-9个月的患者6例设为4组、10-12个月的患者7例设为5组及12个月以上者6例设为6组，各组CRBN蛋白相对表达量分别是(1.52±0.08) pg/ml、(1.17±0.08）pg/ml、(1.09±0.04) pg/ml、(1.09±0.02) pg/ml、(1.04±0.03) pg/ml、(1.03±0.03) pg/ml，各组间CRBN蛋白相对表达量呈下降趋势，其中1组、2组、3组相比各组间有统计学意义（p=0.000），,3组、4组、5组、6组各组之间无统计学差异（p=0.300）。3初治组治疗疗效与CRBN表达水平的关系RT-PCR结果显示：治疗1个疗程或多个疗程达到PR及以上的初治患者治疗前后CRBN mRNA相对表达量分别为(3.50±0.71）、(1.65±0.48)，未达到PR的初治患者其治疗后CRBN mRNA相对表达量分别为(0.56±0.11)、(0.50±0.14)，正常对照组BM-MNCs CRBN mRNA相对表达量为(0.64±0.20)。治疗1个疗程或多个疗程达到PR及以上的初治患者CRBN mRNA相对表达水平明显高于未达到PR患者的组，其差异具有统计学意义（p=0.000），且明显高于对照组，治疗后基因水平下降，但仍高于正常对照组，其差异具有统计学意义（p=0.000）。未达到PR的患者CRBN mRNA相对表达水平在治疗前后无明显变化，差异无统计学意义（p=0.733），与正常对照组相比差异无统计学意义（p=0.733）。Western blot显示：治疗1个疗程或多个疗程达到PR及以上的初治患者治疗前后CRBN蛋白相对表达水平分别为(1.51±0.07) pg/ml、(1.10±0.07) pg/ml，未达到PR的初治患者其治疗前后CRBN蛋白相对表达水平分别为(0.94±0.24）pg/ml、(0.88±0.22) pg/ml正常对照组BM-MNCs CRBN蛋白相对表达水平为(0.86±0.08) pg/ml。治疗1个疗程或多个疗程达到PR及以上的患者CRBN蛋白相对表达水平明显高于未达到PR患者的组，其差异具有统计学意义（p=0.000），且明显高于正常对照组，治疗后蛋白水平下降，仍高于对照组，其差异具有统计学意义（p=0.000）。未达到PR的患者CRBN蛋白相对表达水平在治疗前后无明显变化，差异无统计学意义（p=0.428），与正常对照组相比差异无统计学意义（p=0.428）。结论：1新诊断的多发性骨髓瘤患者CRBN的表达水平高于沙利度胺治疗后的患者，进一步证明CRBN是沙利度胺的作用靶点；对于初治MM患者，达到PR的患者CRBN的表达水平高于未达到PR的患者，进一步表明CRBN可能与MM的治疗疗效相关。2随着沙利度胺维持治疗时间不同，CRBN表达水平逐渐下降，基因水平的降低慢于蛋白水平的降低。3CRBN基因与蛋白的表达可能存在一定的相关性。