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目的观察1型糖尿病SD大鼠糖尿病早期阶段(即4周)中枢和外周神经系统中线粒体形态结构、数量以及线粒体动力学相关蛋白的变化或差异性表达情况。并且同时进行体外实验培养大鼠脊髓前角运动神经元细胞(VSC4.1),观察正常组和高糖干预组细胞内线粒体所发生的变化。进一步探讨线粒体动力学与糖尿病神经系统病变之间的关系、糖尿病神经病变发生发展的潜在机制,并为治疗该疾病提供可能的机制理论基础和证据。方法选取雄性SD大鼠30只,随机分为2组:正常对照组(Control组)和糖尿病组(DM组),正常对照组13只,糖尿病组12只。分别取各组大鼠6只用于透射电镜观察和免疫荧光检测,而剩余大鼠用于免疫印迹法(WB)检测。1.运用透射电镜观察两组大鼠4周时皮质、海马、颈髓后角、腰髓后角和背根神经节等组织部位的神经元细胞中线粒体形态结构及数量的改变;2.应用免疫荧光方法观察两组大鼠4周时皮质、海马、颈髓后角、腰髓后角等部位中线粒体动力学相关蛋白1(Drp1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)和线粒体标志物(VDAC1)的差异性表达情况。3.通过运用WB方法测定线粒体标志物(VDAC1)、线粒体视神经萎缩因子1(Opa1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、线粒体外膜小分裂蛋白1(Fis1)和线粒体动力学相关蛋白1(Drp1)的表达来反映线粒体动力学改变。并且体外培养大鼠脊髓前角运动神经元细胞(VSC4.1),通过透射电镜、WB检测以及线粒体荧光染色实验观察正常组和高糖干预组细胞中线粒体形态学、数量以及线粒体动力学相关蛋白的变化。结果1、透射电镜观察发现,糖尿病组大鼠其腰髓后角和背根神经节部位的神经元细胞中线粒体的体积增大,轻-中度肿胀,部分出现了空泡化。线粒体内、外膜尚保持完整,线粒体嵴出现轻度肿胀的现象,其内在的基质颗粒则表现为部分减少或缺失;线粒体形态结构、长度、长宽比和数量变化与正常对照组相比差异有统计学意义(p<0.01)。2、免疫荧光观察发现,糖尿病组大鼠腰髓后角中Drp1和VDAC1荧光阳性染色表达量明显增多;Mfn1荧光阳性染色表达量明显减少,与正常对照组相比其差异有统计学意义(p<0.01)。3、WB结果显示:糖尿病组大鼠腰髓后角和背根神经节部位中VDAC1、Fis1和Drp1的灰度值表达明显上调;而Mfn1、Mfn2和Opa1的灰度值表达明显下调,与正常对照组相比其差异有统计学意义(p<0.01)。4、电镜显示,高糖干预组细胞中线粒体的体积均明显增大且肿胀、空泡化;大量肿胀的线粒体相互堆积;部分线粒体内膜出现断裂;线粒体嵴肿胀、破裂表象显著;内在的基质颗粒大量缺失,与正常组相比线粒体形态结构、长度、长宽比和数量变化其差异有统计学意义(p<0.01)。5、WB实验结果显示,高糖干预下细胞中Drp1、Fis1和VDAC1灰度值表达明显增加;Mfn1、Mfn2和Opa1灰度值表达明显减少,与正常对照组相比其差异有统计学意义(p<0.01)6、线粒体Mitotracker Red荧光染色对正常和高糖干预组细胞中的线粒体进行静、动态观察。发现高糖干预组细胞中线粒体分裂占据明显优势并形成了片段的、不连续的网络。在神经元细胞的胞体和轴突中出现了大量的、碎片化的、又小又圆的线粒体,且呈现出聚集的现象,而神经元轴突中线粒体的数量却明显减少,与正常组细胞相比均有明显变化。结论1、形态学异常、动力学失衡、数量增加,线粒体的这些改变是促使糖尿病神经系统病变发生或发展的潜在机制之一;也是导致神经系统发生病理生理损害以及功能障碍的前提和基础。2、糖尿病神经系统病变发生在糖尿病的早期阶段,以外周神经系统病变最先开始,而中枢神经系统未发生改变。3、体外实验中高糖刺激下的VSC4.1细胞中线粒体分裂显著并形成了不连续的网络。这些改变也为糖尿病神经系统病变发生与发展的研究提供了一定的理论基础。