脯氨酰羟化酶2(PHD2)是调节细胞中缺氧诱导因子HIF-1α含量相对稳定的关键氧感受器。在常氧条件下,PHD2通过氧依赖性途径催化HIF-1α保守区域LXXLAP特定位点上的脯氨酸残基发生羟基化反应,随后经特定途径降解;在缺氧条件下,该反应受到抑制,HIF-1α转移到细胞核中与HIF-1β形成异二聚体,促进相关缺氧诱导基因的表达。通过PHD2来调控HIF-1α的转录活性,可以为与HIF相关的缺氧缺血性疾病及癌症提供潜在的治疗方法。本研究的主要目的是通过In-Fusion方法高效地构建PHD2原核表达载体,用Nus-Tag融合标签实现PHD2在大肠杆菌中的可溶性表达,进一步对重组蛋白的活性进行测定及分析。首先,用Sac I酶切pET-43.1b(+)原核质粒制备线性化载体,设计特异性In-Fusion引物,以重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,采用PCR法扩增出与线性化载体两端具有同源序列的目的基因,再用In-Fusion方法构建原核表达载体pET-43.1b(+)-PHD2。然后,将pET-43.1b(+)-PHD2转化至大肠杆菌中诱导表达,分别对表达菌株及诱导表达条件进行优化。用SDS-PAGE分析蛋白样品,用Western Blot对重组蛋白进行鉴定。最后,采用Ni-NTA亲和层析法纯化融合蛋白,初步研究纯化后的蛋白对HIF-1α肽段的催化活性,并用液相色谱-质谱检测羟基化反应产物。研究结果表明,采用In-Fusion方法成功构建了pET-43.1b(+)-PHD2原核表达载体,确定E.coli BL21(DE3)为最优表达菌株,且Nus-PHD2融合蛋白以可溶性形式表达,Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。最佳诱导表达条件为：诱导时间12 h,IPTG诱导剂浓度0.8 mmol/L,诱导温度30℃。用纯化后的蛋白与HIF-1α肽段进行羟基化反应,经液相色谱-质谱检测有羟基化产物生成,说明表达出的Nus-PHD2具有催化活性。本论文为PHD2生物学功能的深入研究奠定了良好基础。