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研究目的1.通过构建不同肿瘤动物模型,验证免疫治疗联合化疗的增效作用。通过体外观察化疗药物对不同肿瘤细胞甘露糖-6-磷酸受体(M6PR)的影响以及相应小鼠肿瘤模型体内肿瘤细胞M6PR的表达变化,探讨化疗对肿瘤细胞M6PR的作用。构建表达荧光素酶的野生型(H2Kb+/+)B16F10细胞(B16-Luc)及B16F10H2Kb-/细胞(B16-H2Kb-)。用control shRNA或是M6PR shRNA转染B16-H2Kb细胞,分别建立其肿瘤小鼠模型并给与不同治疗方法,体内验证M6PR在免疫治疗联合化疗中的作用。2.观察体内、外化疗后不同肿瘤细胞M6PR mRNA及其蛋白表达情况,同时检测肿瘤细胞内M6PR主要配体IGF-Ⅱ水平的变化。体外观察化疗药物对肿瘤细胞自噬现象的影响。通过上调以及阻断细胞自噬,观察化疗对M6PR在肿瘤细胞内的分布情况,探讨IGF-Ⅱ及自噬在免疫治疗联合化疗中的作用。研究方法1.应用流式细胞仪检测B16F10恶性黑色素瘤、4T1乳腺癌以及人多发性骨髓瘤U266肿瘤细胞系,经化疗后肿瘤细胞表面MPR的表达状况。分别建立上述肿瘤小鼠模型,应用免疫组化方法动态检测化疗后肿瘤组织中M6PR的表达水平。构建表达荧光素酶的野生型(H2Kb+/+)B16F10细胞(B16-Luc)及B16F10H2Kb-/-细胞(B16-H2Kb-)。用control shRNA或是M6PR shRNA转染B16-H2Kb-细胞,分别建立其肿瘤小鼠模型,分别给与不同治疗方案,采用直接测量肿瘤大小以及活体成像技术动态监测肿瘤进展。2.采用Real-time PCR和Western blotting方法检测体内、外经TAX、DOX化疗后B16F10、4T1、U266肿瘤细胞M6PR mRNA以及M6PR总蛋白和膜蛋白表达情况。应用免疫组化和Western blotting方法检测上述肿瘤细胞内M6PR主要配体IGF-II水平的变化,探索化疗上调肿瘤细胞表面M6PR的潜在机制。应用激光共聚焦显微镜观察化疗药物对肿瘤细胞自噬现象的影响。通过自噬抑制剂3-MA或atg5siRNA下调自噬以及通过自噬诱导剂Rapamycin上调自噬,应用流式细胞仪和共聚焦显微镜观察化疗对M6PR在肿瘤细胞内的分布情况。结果1.免疫治疗联合化疗的抗肿瘤效应在MC38结肠癌小鼠模型中,与无治疗模型对照组相比,单一p53DC疫苗免疫治疗延缓了肿瘤的进展(P<0.05),单一TAX化疗也延缓了肿瘤的生长,但是治疗一经停止肿瘤迅速进展。与单一治疗相比,免疫治疗联合化疗显著的抑制了肿瘤的生长(P<0.05)。在TUBO乳腺癌小鼠模型中,与无治疗模型对照组相比,单一TAX化疗没有显著的抗肿瘤作用(P>0.05),单一Neu DC疫苗有轻微延缓肿瘤生长的作用(P>0.05)。与单一治疗相比,DC疫苗联合TAX治疗产生了显著的抗肿瘤效果(P<0.05)。在EG-7淋巴瘤小鼠模型中,与无治疗模型对照组相比,单一过继性T细胞免疫治疗或是TAX化疗均导致肿瘤缩小(P<0.05)。与单一治疗相比,联合治疗的抗肿瘤效应显著增强(P<0.05)。2.化疗对肿瘤细胞表面M6PR的影响(1)小鼠B16F10恶性黑色素瘤、4T1乳腺癌以及人多发性骨髓瘤8226、929、U266多种肿瘤细胞体外经化疗后细胞表面M6PR均上调性表达(P<0.05)。上述肿瘤细胞经化疗后摄取颗粒酶B也显著增加(P<0.05)。在B16F10恶性黑色素瘤、4T1乳腺癌小鼠模型中,TAX给药48小时后,免疫组化显示肿瘤组织M6PR表达显著性上调(P<0.05)。在给药后72小时,M6PR仍保持较高状态,在给药后5天其恢复到治疗前水平。在U266人多发性骨髓瘤裸鼠模型中,经DOX治疗后M6PR发生同样的变化。(2)在B16F10荷瘤小鼠,与无治疗对照相比,单一Pme1-1CTLs或是TAX显著的抑制了肿瘤的生长,但是停止治疗后一周肿瘤继续增长。TAX联合T细胞治疗抗肿瘤效应显著增强(P<0.05)。T细胞输入2天之后给与TAX出现上述增强效应；而T细胞输入5天之前给与TAX,未观察到增强效应。3.M6PR在化疗联合免疫治疗的抗肿瘤效应中的作用(1)在转染了control shRNA的B16F10荷瘤小鼠中,与单一治疗相比,TAX联合Pme1-1CTL治疗抗肿瘤效应显著增强(P<0.05)。在转染了M6PR shRNA的荷瘤小鼠中,联合治疗未显示出增强作用(P>0.05)。(2)在B16F10M6PR shRNA Kb荷瘤小鼠中,与未治疗对照相比,单一Trp2180-188CTLs未显示抗肿瘤活性(P>0.05)。与单一TAX化疗相比,联合治疗未显示出增强作用(P>0.05)。在B16F10control shRNA Kb荷瘤小鼠中,联合治疗也未显示出增强作用(P>0.05)。(3)在B16F10-Luc(左侧肋腹)、control shRNA Kb"(右侧肋腹)双侧肿瘤小鼠模型中,针对B16F10-Luc肿瘤,联合治疗比单一免疫治疗或化疗显示出增强的抗肿瘤效应(P<0.05)；针对control shRNA Kb肿瘤,联合治疗未显示出增强作用(P>0.05)。在B16-Luc与control shRNA Kb-混合肿瘤模型中,与单一治疗相比,联合治疗导致肿瘤总体积显著缩小(P<0.05)。应用活体成像技术监测肿瘤组织中的B16F10-Luc细胞,联合治疗比单一免疫治疗或化疗显示出增强的抗肿瘤效应(P<0.05)。在B16-Luc与M6PR shRNA Kb-混合肿瘤模型中,与单一治疗相比,联合治疗未导致肿瘤总体积缩小(P>0.05)。应用活体成像技术监测肿瘤组织中的B16F10-Luc细胞,联合治疗比单一免疫治疗或化疗显示出增强的抗肿瘤效应(P<0.05)。4.化疗对肿瘤细胞内M6PR合成、讲解以及再分布的影响(1)Real-time PCR结果显示,在M6PR mRNA表达水平上,化疗药物对B16F10、4T1和EL-4肿瘤细胞没有显著影响(P>0.05)。流式细胞分析数据显示,B16F10或是4T1肿瘤细胞经过TAX处理后,细胞表面上的M6PR被上调表达(P<0.05),细胞内M6PR总蛋白表达水平没有发生变化(P>0.05)。Western blotting结果显示,用TAX处理B16F10细胞或是用DOX处理EL-4、U266细胞后,M6PR总蛋白表达水平没有明显变化(P>0.05), M6PR膜蛋白水平显著增加(P<0.05)。(2)激光共聚焦显微镜结果显示,在U266肿瘤细胞内化疗前M6PR集中在细胞浆内,而化疗后其主要定位于细胞膜；在多发性骨髓瘤患者骨髓切片中,治疗前只有20%的肿瘤细胞出现M6PR在细胞膜上的聚集现象,化疗后3天该比例增至50%以上(P<0.05)。5.自噬对肿瘤细胞内M6PR再分布的影响(1)流式细胞分析结果显示,经TAX预处理的B16F10细胞体外与重组IGF-Ⅱ共同孵育,细胞表面M6PR上调表达的能力缺失,细胞摄取颗粒酶B的能力也明显下降(P<0.05)。Western blotting结果显示,化疗药物体外对4T1、EL4、B16F10三种肿瘤细胞内IGF-Ⅱ表达水平没有显著作用(P>0.05)；4T1和B16F10荷瘤小鼠经TAX体内处理后,肿瘤组织中IGF-Ⅱ水平显著增加(P<0.05)。(2)激光共聚焦显微镜结果显示,应用TAX、CIS、DOX处理肿瘤细胞后,自噬被迅速诱导。应用3-MA抑制自噬,DOX原先诱导的U266细胞表面M6PR的上调表达能力明显下降(P<0.05)；经过TAX处理后的B16F10细胞也出现此现象。应用atg5siRNA转染B16F10细胞下调自噬,TAX原先诱导的细胞膜M6PR的上调性表达现象显著下降(P<0.05)。应用Rapamycin诱导自噬,肿瘤细胞表面的M6PR明显增加(P<0.05)。用LC3-GFP转染B16F10肿瘤细胞,未经化疗处理的细胞没有观察到M6PR和LC3的共定位；细胞经TAX处理之后,更容易观察到自噬小体和M6PR的共定位现象。结论化疗可以增强CTL免疫治疗的效果,而该效应与M6PR介导的细胞内吞相关。化疗后肿瘤细胞表面M6PR的短暂诱导介导了化疗联合免疫治疗的旁观者效应,有利于二者产生协同作用。该作用与化疗诱导的自噬相关,而与肿瘤细胞内的IGF-Ⅱ水平无关。