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维甲酸诱导基因I (retinoic acid inducible-gene I, RIG-I)是细胞质中的模式识别受体,RIG-Ⅰ能够识别病毒复制产生的双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)和5’三磷酸基团的单链RNA(single stranded RNA, ssRNA),并且通过激活Ⅰ型干扰素来引发抗病毒免疫反应。本实验以肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CoxsackieA16, CA16)以及人类免疫缺陷病毒(HIV)为研究对象,探讨RIG-I激活后对EV71复制的影响,RIG-I对EV71和CA16及HIV的非编码区(UTR)的识别作用,柯萨奇病毒A组16型和HIV对RIG-I介导的信号通路的影响,以明确RIG-I介导的抗病毒免疫应答以及病毒对RIG-I的抑制机理。1.分别用Poly(I:C)和表达RIG-IN端的质粒转染RD细胞,24h后感染EV71,24h后收获细胞和上清。提取细胞RNA并反转录为cDNA, Real-time PCR测定细胞中RIG-I与IFN-p的mRNA的表达水平和EV71的RNA水平,用免疫印迹的方法检测RIG-I和EV71的蛋白表达水平,将感染病毒的细胞上清进行病毒滴度的测定。研究结果表明：RIG-I被激活之后RIG-I与IFN-p的mRNA的表达水平上升,并且RIG-I的蛋白表达可以被检测到。感染细胞中的EV71的RNA水平和病毒蛋白表达水平下降,并且病毒滴度显著降低。2.将表达RIG-I全长的质粒和带有IFN-p启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒及内对照报告载体转染293T细胞,24h之后将体外转录合成及纯化的EV71、CA16和HIV的UTR转染293T细胞,24h后检测报告基因活性。将UTR转染RD细胞,24h后用免疫印迹的方法检测IRF-3的单体和二聚体。将带有绿色荧光蛋白(GFP)的IRF-3转染RD细胞,24h后将UTR转染RD细胞,24h后荧光显微镜观察。将转染Flag-RIG-I质粒的RD细胞提取物与生物素标记的RNA孵育,用streptavidin agarose beads将细胞提取物pull-down,之后SDS-PAGE分析并用抗Flag的抗体免疫印迹。将RIG-I与UTR进行免疫共沉淀实验。研究结果表明：UTR能够诱导IFN-β启动子的活性,转染UTR后,内源的IRF-3的二聚体可以被检测到,并且可以使活化的IRF-3进入细胞核,RNA结合试验证明合成的UTR能够与RIG-I相结合。3.将带有IFN-β启动子的萤火虫荧光素酶报告质粒pIFN-β-luc及内对照报告载体pRL-CMV转染细胞,之后用CA16感染细胞,24h后检测报告基因活性。将CA16感染细胞,在感染6h、12h、24h以及48h后用Real-time PCR方法测定细胞中IFN-β的mRNA的表达水平。将pIFN-β-luc、pRL-CMV、表达RIG-Ⅰ质粒和表达CA16的3C蛋白质粒或HIV的蛋白酶共转染细胞,24h后检测报告基因活性。将表达RIG-Ⅰ基因N端质粒、带有绿色荧光蛋白GFP的IRF-3质粒以及表达CA16的3C蛋白或HIV的蛋白酶共转染细胞,24h后用荧光显微镜观察。将表达RIG-I的质粒、表达IPS-1的质粒和表达CA16的3C蛋白质粒或HIV的蛋白酶共转染细胞,24h后用免疫共沉淀方法验证蛋白质问相互作用。研究结果表明：CA16感染细胞不能引起IFN-β表达的上调,CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶抑制了RIG-I诱导的IFN-β的启动子活性以及IRF-3的核迁移,CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶与RIG-I存在相互作用,并且3C蛋白和HIV的蛋白酶阻碍了RIG-Ⅰ对接头蛋白IPS-1的招募。研究证实：RIG-Ⅰ的激活以及其诱导的IFN-β对EV71的复制有抑制效应：EV71、CA16和HIV的UTR可以被RIG-I识别并且激活信号转导从而诱导Ⅰ型干扰素的产生：CA16的3C蛋白和HIV的蛋白酶通过与RIG-I相互作用从而抑制RIG-I介导的IFN-p的诱导。