研究背景：甲基苯丙胺(Methamphetamine, METH)属于苯丙胺类神经兴奋剂(Amphetamine-Typed Stimulant, ATS),由于其盐酸盐为透明的结晶体,外观似冰,又被称作“冰毒”,是一种新型毒品,也是目前危害最为严重和广泛的毒品之一。二十世纪末,以甲基苯丙胺为代表的新型毒品由于其生产和加工相对简单,吸食毒品的成本更为低廉,已逐步替代以罂粟为主要原料的传统毒品,并迅速在世界各国蔓延。2014年我国国家食药监总局发布的年度报告统计分析显示,受国际毒潮持续泛滥和国内多种因素影响,我国毒品形势依然不容乐观,以海洛因为代表的传统毒品快速蔓延势头得到进一步遏制,而以甲基苯丙胺为主的新型合成毒品滥用人员增长迅速。与吸毒相关的暴力行为、吸毒死亡、复吸及戒断性猝死是法医工作中十分关注的问题,吸毒造成脏器损伤甚至死亡的机制尚不明确,这也成为了近年来的研究热点。甲基苯丙胺的毒性作用主要影响中枢神经系统,尤其是多巴胺能神经通路。甲基苯丙胺首先通过多巴胺转运体进入多巴胺能神经元胞体内,再经由突触囊泡上的单胺转运体进入囊泡,导致多巴胺(DA)大量释放入胞质,多巴胺(DA)发生自我氧化后产生大量毒素,引起氧化应激、线粒体功能障碍,并最终导致神经元死亡。近年来,大量研究显示,METH具有很强的神经毒性,可导致大脑出现与阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)和帕金森病(Parkinson’s disease, PD)等退行性神经病变类似的病理学改变。我们实验室先前的研究证明,METH能够引起多巴胺能神经元IGFBP5(胰岛素样生长因子结合蛋白5)和caspase家族成员之一caspase-11的表达上调,进而激活线粒体相关caspase-3/PARP凋亡通路,最终导致多巴胺能神经元发生凋亡。除了凋亡,细胞自噬在METH诱导的神经元死亡过程中也扮演着重要角色,只是METH诱导神经元发生自噬的具体机制尚不明确,值得我们深入研究。近年来,越来越多的研究显示,METH对心血管系统也能造成不良,甚至是致死性的损害。不论是单次大剂量吸食METH还是长达数年的滥用,都能对人体造成各种各样的心脏损害。有澳洲学者对澳大利亚2000年7月至2005年6月期间因滥用METH致死的371个案例进行解剖及病理学观察,结果发现有54%的死者患有非常典型的冠状动脉粥样硬化症,提示我们METH滥用所致的猝死可能是由于甲基苯丙胺对心脏产生的毒性作用所致。我们实验室近期通过体外实验证明,METH能够诱导大鼠心肌细胞发生凋亡,其具体的作用机制还有待我们进一步的研究。DNA损伤诱导转录因子4 (DNA damage-inducible transcript 4, DDIT4)又被称作REDD1或者Dig2,蛋白分子量为35kDa,在人体各个部位不同组织中均有表达。DDIT4在健康的生理状况下表达量很低,一旦组织细胞受到缺氧、氧化应激、DNA破坏或其它的刺激DDIT4的表达会明显增强。有研究表明,已分化的PC12细胞发生缺氧时,DDIT4表达上调,进而激活caspase-3/PARP通路,最终导致PC12细胞发生凋亡。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白系统(mammalian target of rapamycin, mTOR)是蛋白质合成的重要调节因子,具有丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶活性,对于细胞的生长、增殖和新陈代谢等起着调节作用。DDIT4是mTOR信号通路的负调节蛋白,它通过mTOR信号通路抑制mTOR磷酸化,最终导致自噬的发生。有研究表明,当机体发生酒精中毒时,心脏组织中DDIT4的表达会明显增强,当心脏组织发生局部缺血再灌注损伤时,DDIT4表达上调并激活nTOR信号通路。然而,关于DDIT4在METH诱导的神经毒性以及心血管毒性中的作用,尚未见报道。本课题拟分两部分,分别探讨DDIT4在甲基苯丙胺介导的神经毒性以及心脏毒性中所发挥的作用。在文章第一部分,从体内与体外两个研究体系入手,构建PC12细胞、SH-SY5Y细胞的METH染毒模型以及METH中毒大鼠模型,对两种细胞及染毒大鼠前额叶皮质、海马、纹状体区域DDIT4表达及细胞自噬情况进行检测。通过小干扰RNA片段阻断DDIT4的表达或者引入抑制剂雷帕霉素(Rap)阻断mTOR信号通路,检测自噬Maker基因beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡Maker基因caspase-PARP表达情况的变化,并且加入功能学实验,如GFP-LC3免疫荧光技术,流式细胞技术等探讨以上变化是否对METH引起多巴胺能神经元自噬和凋亡产生保护作用。再通过立体定位技术注射重组病毒至大鼠纹状体,静默DDIT4,给予METH刺激,分离纹状体区域,检测自噬与凋亡Maker基因的变化,与细胞实验相互印证。初步阐明DDIT4在METH神经毒性损伤中的作用机制。第二部分,构建原代大鼠心肌细胞的METH染毒模型以及METH中毒大鼠模型,对细胞及染毒大鼠心肌组织DDIT4表达及自噬与凋亡情况进行检测。通过小干扰RNA片段阻断DDIT4的表达或者引入抑制剂雷帕霉素(Rap)阻断mTOR信号通路,检测自噬Maker基因beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡Maker基因caspase-PARP表达情况的变化,并且加入功能学实验,如GFP-LC3免疫荧光技术,TUNEL染色等,研究DDIT4在METH心脏毒性损伤中的作用机制,为METH神经毒性、心脏毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据。目的：通过体内动物模型实验和体外细胞模型的实验,验证DDIT4以及自噬、凋亡 maker基因在METH处理后的表达变化情况,研究DDIT4与mTOR信号通路的相互关联,并且通过功能学实验,检测DDIT4的表达变化对细胞自噬、凋亡maker基因的影响。最终初步阐明DDIT4在METH诱导的自噬和凋亡中的作用,为METH神经毒性、心脏毒性损伤机制研究及基因干预治疗提供理论依据。方法：第一部分DDIT4在METH诱导的多巴胺能神经元凋亡与自噬中的作用1.DDIT4在METH中毒PC12细胞、SH-SY5Y细胞模型中的表达及静默DDIT4基因对mToR信号通路和细胞自噬的影响(1)CCK8法测定不同浓度的METH处理后PC12细胞和SH-SY5Y细胞的LC25,LC50;(2) Western-blot及Q-PCR检测METH处理后DDIT4的表达与浓度、时间梯度的关系；(3) Western-blot检测METH处理后PC12细胞和SH-SY5Y细胞自噬的情况；(4) Western-blot、GFP-LC3转染及电镜检测静默DDIT4基因对METH诱导的PC12细胞自噬的影响；(5) Western-blot检测Rap以及3-MA在METH诱导的PC12细胞和SH-SY5Y细胞自噬中的作用;(6) Western-blot、流式细胞术检测静默DDIT4基因对METH诱导的PC12细胞和SH-SY5Y细胞凋亡的影响。2. DDIT4在亚急性与慢性METH中毒大鼠模型各脑区的表达情况及慢病毒沉默DDIT4蛋白对亚急性METH中毒大鼠模型纹状体区域自噬与凋亡Maker基因的影响(1) Western-blot测定亚急性与慢性METH中毒大鼠模型各脑区DDIT4及自噬Maker基因表达情况；(2) Western-blot检测慢病毒沉默DDIT4蛋白对纹状体区域自噬及凋亡Maker基因的影响。第二部分DDIT4在METH诱导的大鼠心肌细胞凋亡与自噬中的作用1. DDIT4在METH中毒大鼠心肌细胞中的表达及静默DDIT4基因对mToR信号通路和细胞凋亡、自噬的影响(1) Western-blot检测METH处理后DDIT4的表达及心肌细胞自噬与凋亡的情况；(2) Western-blot、GFP-LC3转染检测静默DDIT4基因对METH诱导的心肌细胞自噬的影响；(3) Western-blot、TUNEL染色检测静默DDIT4基因对METH诱导的心肌细胞凋亡的影响；(4) Western-blot检测Rap对METH诱导的心肌细胞自噬和凋亡的影响；2.亚急性与慢性METH中毒大鼠模型心肌组织中自噬与凋亡的发生以及DDIT4的表达情况(1) Western-blot测定大鼠模型心肌组织中DDIT4及自噬Maker基因表达情况；(2) Western-blot、TUNEL染色检测大鼠模型心肌组织凋亡情况。结果：1.DDIT4在METH诱导的多巴胺能神经元凋亡与自噬中的作用(1) METH能够诱导多巴胺能神经元发生自噬：以1 mmol/L METH处理PC12细胞,Beclin-1与LC3-Ⅱ的蛋白表达升高1.5倍,随后随着浓度的升高,表达量逐渐升高,当给药浓度达到3mmol/L时达到顶峰,与空白对照组Ommol/L METH相比升高了3.0倍,具有显著差异。选择3.0 mmol/L METH处理浓度,以时间梯度处理PC12细胞。结果发现,METH处理2小时后,Beclin-1与LC3-Ⅱ的蛋白表达升高1.5倍,24小时达到峰值,各组与空白对照组相比均有显著性差异。在细胞正常对照组Beclin-1与LC3-Ⅱ蛋白表达量较低,以2.0mmol/L METH处理SH-SY5Y细胞,24h后Beclin-1与LC3-Ⅱ的蛋白表达升高了4.0倍,具有显著差异。(2)METH作用于多巴胺能神经元,引起DDIT4的mRNA和蛋白表达上调：以1mmol/L METH处理PC12细胞,DDIT4的蛋白表达开始升高,随后随着浓度的升高,DDIT4表达量逐渐升高,3mmol/L METH处理时达到顶峰,与空白对照组Ommol/L METH相比升高了4.2倍,具有显著差异。mRNA的表达情况也表现出相似结果,1mmol/L METH处理PC12细胞,DDIT4的mRNA表达开始升高,随后随着浓度的升高,其表达量逐渐升高,3mmol/L METH处理时达到顶峰,与空白对照组相比升高了4.24倍,具有显著差异。(3) METH导致SD大鼠多个脑区DDIT4蛋白表达升高,进而诱发自噬：在前额叶皮质区域,亚急性组与慢性组DDIT4的蛋白表达较空白对照组分别上升了1.63倍和2.1倍,自噬Maker基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达变化与DDIT4趋势一致,亚急性组与慢性组的蛋白表达量较空白对照组分别上升了2.4倍和3.5倍。在海马区域,亚急性组与慢性组DDIT4的蛋白表达较空臼对照组分别上升了2.65倍和4.38倍,自噬Maker基因Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达变化与DDIT4趋势一致,亚急性组与慢性组的蛋白表达量较空白对照组分别上升了2.0倍和3.0倍。在纹状体区域,亚急性组与慢性组DDIT4的蛋白表达较空白对照组分别上升了3.33倍和2.54倍,自噬Maker基因Beclin-ⅠLC3-Ⅱ的表达变化与DDIT4趋势一致,亚急性组与慢性组的蛋白表达量较空白对照组分别上升了4.6倍和4.0倍。(4)合成的小干扰siDDIT4能够有效的静默细胞中DDIT4的表达：3.0mmol/L METH处理24h后,siNC组DDIT4蛋白表达量较空白对照组升高了2.5倍,敲除DDIT4后迅速降低到48.7%。而相同处理后,siNC组DDIT4 mRNA表达量较空白对照组升高了2.5倍,敲除DDIT4后迅速降低到41.0%。(5)静默DDIT4对METH诱导的PC12细胞自噬有保护作用。(6) METH可以引起PC12细胞中p-mTOR表达升高,静默DDIT4可以抑制p-mTOR的表达。(7)Rap能够促进已敲除DDIT4基因的多巴胺能神经元发生自噬,3-MA的作用恰好相反。(8)静默DDIT4对METH诱导的多巴胺能神经元凋亡有保护作用。(9)静默DDIT4能有效抑制METH诱导的细胞凋亡。(10)在SD大鼠纹状体注射慢病毒敲除DDIT4,可以有效的减少METH所引起的该区域的自噬和凋亡。2. DDIT4在METH诱导的原代大鼠心肌细胞凋亡与自噬中的作用(1) METH作用于大鼠心肌细胞,引起DDIT4的蛋白表达上调。(2) METH能够诱导大鼠心肌细胞发生自噬和凋亡。(3)合成的小干扰siDDIT4能够有效的静默大鼠心肌细胞中DDIT4的表达。(4)静默DDIT4对METH诱导的大鼠心肌细胞自噬及凋亡有保护作用。(5)Rap能够促进已敲除DDIT4基因的多巴胺能神经元发生自噬和凋亡。结论：第一部分(1) DDIT4的表达增强对METH诱导的多巴胺能神经元自噬与凋亡有促进作用；(2)静默DDIT4基因对METH诱导的两种细胞的自噬与凋亡均有明显的保护作用,说明DDIT4在METH引起的神经毒性作用中扮演着重要的角色；(3) DDIT4通过mTOR信号通路调控METH介导的多巴胺能神经元自噬；(4) METH诱导多巴胺能神经元自噬,导致Beclin-1/Bcl2复合物合成增加,可能引起细胞死亡内源性抑制因子的耗竭,最终促进细胞凋亡的发生。第二部分(1) METH的刺激能引起大鼠心肌细胞中DDIT4的表达上调；(2) DDIT4对于METH引起的大鼠心肌细胞自噬及凋亡,有一定的调控作用；(3) 敲除DDIT4可以激活mTOR通路,增强mTOR磷酸化,进而抑制METH引起的大鼠心肌细胞自噬及凋亡；(4) 静默DDIT4对于METH引起的大鼠心肌细胞自噬及凋亡有保护作用,而加入mTOR抑制剂雷帕霉素后,此作用发生了逆转。以上发现说明,DDIT4在METH诱导的大鼠心肌细胞自噬及凋亡过程中,发挥了重要作用。综上所述,DDIT4在METH引起的神经毒性与心脏毒性中,发挥了重要的调控作用。