第一部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣结构及力学性能的影响目的：探讨三种基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣去细胞效果,以及对瓣膜结构、细胞外基质(ECM)成分和力学性能的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：以单纯水溶性蛋白溶解(HSA)、单纯脂溶性蛋白溶解(LSA)、连续水溶性蛋白及脂溶性蛋白溶解(SHLS)和经典方法(TSI)对猪主动脉瓣进行去细胞处理。DAPI染色评价去细胞效果;组织学染色(HE、Masson和EVG染色)评价不同去细胞方法对瓣膜结构、胶原纤维和弹性纤维的影响。扫描电镜观察瓣膜表面的微观结构。定量检测瓣膜的含水量、胶原蛋白、弹性蛋白和糖胺聚糖(GAGs)的含量,评价不同去细胞方法对ECM成分的影响。应用单轴拉伸试验进行瓣膜力学性能测定,评价不同去细胞方法对力学性能影响。结果：HSA去细胞方法对瓣膜结构和ECM成分的损伤最小,但在四种去细胞方法中仅HSA不能完全去除瓣膜的细胞成分。LSA去细胞方法对瓣膜结构破坏严重,Masson染色显示胶原纤维染色较浅,EVG染色显示弹性纤维几乎被完全去除。SHLS去细胞方法对瓣膜结构影响较小,Masson染色显示胶原纤维保存良好,EVG染色显示弹性纤维轻度减少。TSI去细胞方法对瓣膜结构亦有影响,Masson染色显示胶原纤维有所减少,尤其是纤维层的胶原纤维：EVG染色显示弹性纤维明显减少。ECM定量检测结果显示四种去细胞瓣膜含水量均显著高于天然瓣膜,且胶原蛋白含量与天然瓣膜差异无统计学意义：仅HSA去细胞方法没有降低瓣膜弹性蛋白含量,而LSA、SHLS和TSI去细胞瓣膜弹性蛋白含量较天然瓣膜显著减少：四种去细胞方法均降低了瓣膜GAGs含量。力学性能测试结果显示四种去细胞方法增加了瓣膜在周向和径向上的极限拉伸应变,但HSA、SHLS和TSI去细胞方法并没有显著降低瓣膜的极限抗张强度和弹性模量,而LSA去细胞瓣的周向弹性模量显著下降。结论：SHLS去细胞方法能有效去除猪主动脉瓣膜细胞成分,且对瓣膜结构、ECM成分及力学性能损伤较小。第二部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外免疫原性及生物相容性的影响第一节：基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外免疫原性的影响目的：探讨三种基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣中异种抗原的去除效果,评价不同去细胞方法处理的瓣膜体外对白细胞和补体系统激活的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：以HSA、LSA、SHLS和TSI对猪主动脉瓣进行去细胞处理。免疫荧光染色检测去细胞瓣膜和天然瓣膜中异种抗原α-Gal和MHCI,评价不同去细胞方法对其去除效果。将去细胞瓣膜和天然瓣膜分别与人血孵育,ELISA法检测PMN弹性蛋白酶和SC5b-9水平,评价不同去细胞方法处理的瓣膜体外对白细胞和补体系统激活的影响。结果：免疫荧光染色结果显示天然瓣膜中存在异种抗原α-Gal和MHC Ⅰ; HSA不能有效去除瓣膜中的α-Gal和MHCⅠ;LSA和SHLS可完全去除该两种抗原；TSI可以去除MHC Ⅰ,但不能完全去除α-Gal。与人血孵育后,LSA和SHLS去细胞瓣组PMN弹性蛋白酶水平显著低于HSA、TSI去细胞瓣组和天然瓣膜组；而HSA和TSI去细胞瓣组PMN弹性蛋白酶水平与天然瓣膜组差异无统计学意义。在四种去细胞瓣膜和天然瓣膜间,SC5b-9水平差异无统计学意义。结论：SHLS和LSA去细胞方法可有效去除猪主动脉瓣中的异种抗原α-Gal和MHC Ⅰ,其处理的瓣膜在体外能降低白细胞激活。第二节：基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体外生物相容性的影响目的：分离、培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)作为组织工程瓣膜的种子细胞,探讨基于蛋白溶解的去细胞方法处理的瓣膜对细胞粘附、细胞增殖、细胞毒性以及血液相容性的影响,并与经典去细胞方法比较。方法：采用全骨髓差异贴壁法,从Sprague Dawley大鼠骨髓中分离培养BMSCs。光镜下观察BMSCs细胞形态,流式细胞仪检测BMSCs表面标志物,成骨、成脂诱导体系分别诱导BMSCs定向分化。将BMSCs种植于不同去细胞方法处理的瓣膜上,在细胞种植后2h和24 h以WST-8法测定各组瓣膜上的细胞粘附率。在细胞种植后2d、4 d和8 d,以WST-8法测定各组瓣膜上的细胞增殖数,并以乳酸脱氢酶(LDH)法检测各组瓣膜的细胞毒性。将新鲜人血与各组瓣膜孵育进行溶血试验,检测各组瓣膜的溶血率。结果：成功分离培养大鼠BMSCs,第3代BMSCs在光镜下呈梭形贴壁生长,形态均一,呈放射状规则排列。流式细胞仪结果显示BMSCs表达特异性表面标记物CD90和CD29,不表达CD45,表明均质性好,表型稳定；成骨和成脂体系诱导2w后分别行茜素红染色和油红O染色呈阳性,表明分离的BMSCs具有多向分化潜能。BMSCs种植后2h和24 h,四种去细胞瓣膜上细胞粘附率显著高于天然瓣膜,且SHLS去细胞瓣膜表面细胞粘附率显著高于HSA、LSA和TSI去细胞瓣膜。BMSCs种植后2d,四种去细胞瓣膜上细胞相对增殖率均显著高于天然瓣膜上细胞相对增殖率；BMSCs种植后4d和8 d,四种去细胞瓣膜上细胞相对增殖率仍显著高于天然瓣膜上细胞相对增殖率,且SHLS去细胞瓣膜上细胞相对增殖率显著高于HSA、LSA和TSI去细胞瓣膜。BMSCs种植后2 d,TSI去细胞瓣的细胞毒性显著高于其他组,HSA、LSA和SHLS去细胞瓣膜的细胞毒性与天然瓣膜差异无统计学意义。TSI去细胞瓣的溶血率亦显著高于HSA、LSA、SHLS去细胞瓣膜和天然瓣膜。结论：分离培养的BMSCs可作为组织工程瓣膜种子细胞。在四种去细胞瓣膜中,BMSCs在SHLS去细胞瓣膜表面粘附增殖良好,且SHLS去细胞瓣膜对细胞毒性小、溶血率低。第三部分基于蛋白溶解的去细胞方法对猪主动脉瓣体内组织重塑与钙化的影响目的：探讨基于蛋白溶解的去细胞方法处理猪主动脉瓣植入体内后的炎症反应、组织重塑与钙化,与经典去细胞瓣膜、天然瓣膜和戊二醛(GA)交联瓣膜比较,并探讨巨噬细胞极化在此过程的作用。方法：72只雌性大鼠随机分为6组,建立腹壁缺损模型,应用各组瓣膜对腹壁缺损进行修补。于术后2w和6w取出植入物,行HE和Masson染色观察炎症反应、组织降解、纤维包裹等并进行组织学评分;硝酸银染色和钙含量检测各组瓣膜钙化情况；行免疫荧光和免疫组化染色比较不同处理方法植入物中巨噬细胞的表型变化;RT-PCR检测促炎因子(IL-12、TNF-α、IL-6、IL-1p)、抗炎因子(IL-10、IL-1ra)、巨噬细胞相关指标(iNOS、ARG)、基质金属蛋白酶及其抑制剂(MMP1、MMP2、MMP9、TIMP1、TIMP2)在不同时间点、不同植入物中的基因表达水平；原位明胶酶谱法荧光染色检测MMP2和MMP9活性。结果：组织学分析结果显示LSA和SHLS去细胞瓣膜在体内进行了较好的组织重塑,表现为植入物大量降解,原组织结构不明显,较为规则的ECM形成,组织中央可见肌细胞;HSA和TSI去细胞瓣膜在体内组织重塑较差,表现为植入物内和植入物周围细胞浸润减少,支架部分降解,ECM部分形成,肌细胞生长较少；天然瓣膜和GA交联瓣膜在体内以异物反应为主,表现为大量炎症细胞浸润,无肌细胞生长,组织结构基本完整,被致密的纤维组织包裹。植入体内6w后,硝酸银染色显示仅GA交联瓣膜中可见大量褐黑色沉淀物；钙含量检测结果显示四种去细胞瓣膜中的钙含量均显著低于天然瓣膜和GA交联瓣膜。组织重塑较好的植入物(LSA和SHLS去细胞瓣膜)M2：M1巨噬细胞比率在不同时间点均高于组织重塑较差的植入物(HSA和TSI去细胞瓣膜)和发生异物反应的植入物(天然瓣膜和GA交联瓣膜),而且HSA和TSI去细胞瓣膜的M2：M1巨噬细胞比率在不同时间点亦高于天然瓣膜和GA交联瓣膜的。在植入体内后2w和6 w,抗炎因子在LSA和SHLS去细胞瓣中表达较高,而促炎因子在天然瓣膜和GA交联瓣膜中表达较高。四种去细胞瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs在2w时表达较低,在6w时表达较高。LSA和SHLS去细胞瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs的表达水平在6w显著高于其他四组。GA交联瓣膜植入体内后,MMPs和TIMPs的在不同时间点表达均较高。原位明胶酶谱法荧光染色检测MMPs活性亦得到相同结果。结论：不同去细胞方法处理的瓣膜、天然瓣膜和GA交联瓣膜在体内均引起了程度不一的宿主反应。LSA和SHLS去细胞瓣膜在体内发生了组织重塑。巨噬细胞可通过转化为M1和M2表型,分泌并调节促炎因子与抗炎因子以及MMPs/TIMPs,影响瓣膜在体内组织重塑的过程。